鄭瑀心 閔敏 朱子羽 楊曉紅 曹毅 鄭敏

310053杭州，浙江中醫(yī)藥大學(xué)（鄭瑀心、朱子羽、楊曉紅、曹毅）；江蘇省常州市第一人民醫(yī)院皮膚科（閔敏）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院皮膚科（鄭敏）

甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）是甘草甜素的主要活性代謝產(chǎn)物，對(duì)多種腫瘤如肝癌、肺癌、宮頸癌、胃癌、結(jié)腸癌及白血病等來源的腫瘤細(xì)胞具有廣泛的抑制作用，并且對(duì)于正常體細(xì)胞的毒性較小［1?2］。銀屑病是一種以表皮增殖和炎癥為特征的紅斑鱗屑性皮膚病。臨床上，以甘草甜素為主要成分的復(fù)方甘草酸苷片是銀屑病的輔助治療藥物，已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，并取得了良好的臨床效果。我們?cè)噲D通過研究甘草次酸對(duì)銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、凋亡以及miR?21表達(dá)的影響，初步探討其治療作用機(jī)制，從而為臨床上甘草次酸有效治療銀屑病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為銀屑病防治藥物的研發(fā)提供新的切入點(diǎn)。

材料與方法

一、材料與儀器

甘草次酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司），角質(zhì)形成細(xì)胞完全培養(yǎng)基（美國(guó)Life公司），MTS細(xì)胞增殖試劑盒（美國(guó)Promega公司），凋亡試劑盒、流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司），SYBR熒光定量試劑盒（瑞士Roche公司），PCR儀（美國(guó)Bio?Rad公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)DYNEX公司）。

二、方法

1.銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞分離及原代培養(yǎng)：本研究經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（IRB?2016?023）。2016年9月至2017年10月在浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院收集確診為尋常性銀屑病的患者15例，其中男9例，女6例，年齡（40.21±12.38）歲。自患者皮損部位獲取皮膚標(biāo)本，取材前患者均簽署知情同意書。將皮損標(biāo)本保存于0.5%分離酶中，4℃過夜消化后，于超凈臺(tái)中分離表皮和真皮，表皮置于0.25%胰酶溶液中，37℃溫育10 min。以胎牛血清中止胰酶活性，吹打表皮，以200目濾網(wǎng)過濾角質(zhì)形成細(xì)胞懸液，500×g離心5 min。棄上清液，加入10 ml角質(zhì)形成細(xì)胞完全培養(yǎng)基，接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)［3?4］，隔天換液，傳代2～3次后用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.MTS檢測(cè)甘草次酸對(duì)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響：取銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞單細(xì)胞懸液，以1× 105個(gè)/ml的密度接種于 96孔板中，每孔100 μl。次日細(xì)胞貼壁后換培養(yǎng)液，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即甘草次酸對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）約為6 mg/L，予不同質(zhì)量濃度（1、2、4、8、10 mg/L）甘草次酸干預(yù)，對(duì)照組加入含有0.01%二甲基亞砜（DMSO）的培養(yǎng)基。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。行MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)時(shí)，先將96孔板中培養(yǎng)基棄凈，設(shè)5個(gè)空白對(duì)照復(fù)孔，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組每孔均添加 100 μl角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基及20 μl MTS，于37℃、5%CO2環(huán)境下孵育。1～4 h后，用酶標(biāo)儀于540 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度（A值）。

3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)甘草次酸對(duì)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的影響：取銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞以1×105/ml（500 μl/孔）種于6孔板，待細(xì)胞融合至90%時(shí)，予甘草次酸干預(yù)，使終濃度為1、2、4、8和10 mg/L，對(duì)照組加入含有0.01%DMSO的培養(yǎng)基。作用24 h后收集細(xì)胞。按照BD公司Annexin V/PE和7AAD雙染細(xì)胞凋亡試劑盒說明書處理后，立即行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞miR?21表達(dá)水平：取銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞以1×105/ml（500 μl/孔）種于6孔板，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)，予甘草次酸干預(yù)，使終濃度為1、2、4 mg/L，對(duì)照組加入含有0.01%DMSO的培養(yǎng)基，作用24 h后，Trizol法提取總RNA。再取部分銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞以1×105/ml（500 μl/孔）按上述方法接種于6孔板，予2 mg/L甘草次酸干預(yù)，作用18、24及48 h后，采用Trizol法提取總RNA。用miRNA cDNA合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。設(shè)計(jì)合成引物，miR?21上游引物 5′?ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGA?3′，下游引物5′?TGGTGTCGTGGAGTCG?3′；U6上游引物 5′?CTCGCTTCGGCAGCACA?3′，下游引物 5′?AACGCTTCACGAATTTGCGT?3′。采用熒光定量PCR反應(yīng)體系試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，擴(kuò)增miR?21和U6基因。以U6為內(nèi)參進(jìn)行定量分析，用2?ΔΔCt表示miR?21的表達(dá)量。ΔΔCt=（實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct）-（對(duì)照組目的基因Ct-對(duì)照組內(nèi)參基因Ct）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graph Pad 6.0統(tǒng)計(jì)處理軟件分析。常規(guī)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)、正態(tài)性檢驗(yàn)。計(jì)量資料實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示。采用單因素方差分析和重復(fù)測(cè)量的方差分析統(tǒng)計(jì)組間和組內(nèi)差異，兩兩組間比較采用LSD檢驗(yàn)；相關(guān)性用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、甘草次酸抑制銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖

圖1 甘草次酸對(duì)銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響

見圖1。重復(fù)測(cè)量方差分析顯示，各濃度甘草次酸對(duì)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞體外增殖均有抑制作用，且抑制作用在不同時(shí)間點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 294，P＜ 0.05），藥物作用時(shí)間越長(zhǎng)，抑制作用越強(qiáng)；不同濃度組間增殖抑制率差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=752.7，P＜ 0.05），甘草次酸濃度越高，抑制作用越強(qiáng)；藥物濃度與時(shí)間之間存在交互效應(yīng)（F=45.46，P＜ 0.05）。

二、甘草次酸促進(jìn)銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡

見圖2。1、2、4、8、10 mg/L甘草次酸組與對(duì)照組間銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=59.50，P＜0.05）。兩兩比較顯示，除1 mg/L甘草次酸組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各甘草次酸組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。甘草次酸濃度與銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡率之間呈正相關(guān)（r=0.922，P＜0.05）。

三、甘草次酸抑制銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞miR?21的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞分別經(jīng)1、2、4 mg/L甘草次酸作用24 h后，miR?21表達(dá)水平分別為0.24±0.04、0.22±0.07、0.17±0.05，與對(duì)照組（0.92±0.12）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=213.10，P＜ 0.05）；兩兩比較顯示，1、2、4 mg/L甘草次酸組較對(duì)照組miR?21基因表達(dá)均顯著降低（P＜ 0.01）。2 mg/L作用18、24、48 h時(shí)，miR?21表達(dá)水平分別為0.55±0.02、0.22±0.06、0.15±0.06，與對(duì)照組（0.98±0.02）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=238.10，P＜0.05）；與對(duì)照組比較，2 mg/L甘草次酸處理不同時(shí)間均可降低miR?21基因表達(dá)（P＜0.01），且甘草次酸干預(yù)時(shí)間與miR?21表達(dá)量之間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.949，P＜0.05）。

討 論

已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，甘草次酸可抑制HaCaT細(xì)胞的增殖［5］。本研究顯示，甘草次酸還可明顯抑制銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且隨著藥物濃度增加，凋亡率升高。因此，我們推測(cè)甘草次酸可能通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞增殖。

圖2 甘草次酸處理24 h后對(duì)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的影響 右上象限代表晚期凋亡細(xì)胞

近來，miR?21被發(fā)現(xiàn)在炎癥、腫瘤性疾病中發(fā)揮重要作用。Ahmed等［6］發(fā)現(xiàn)，在皮膚原代角質(zhì)形成細(xì)胞及HaCaT細(xì)胞中，miR?21通過抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein）依賴的抑癌基因PTEN、PDCD4、TIMP3和TPM1等的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖與遷移。國(guó)外學(xué)者還發(fā)現(xiàn)，miR?21在銀屑病患者皮損區(qū)角質(zhì)形成細(xì)胞中高表達(dá)，提示其與增殖相關(guān)，在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用［7?8］。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，清熱涼血方對(duì)外周血miR?21的下調(diào)可能是其治療銀屑病的作用機(jī)制之一［9］；紫草素可明顯抑制表皮生長(zhǎng)因子對(duì)HaCaT細(xì)胞的促增殖作用，其機(jī)制可能為通過抑制miR?21的表達(dá)，達(dá)到抑制HaCaT細(xì)胞增殖的作用［10］。而且，甘草次酸可以抑制HaCaT細(xì)胞miR?21的表達(dá)［11］。但是目前尚無甘草次酸對(duì)銀屑病患者原代角質(zhì)形成細(xì)胞miR?21表達(dá)作用的研究報(bào)道。我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，甘草次酸抑制銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞中miR?21的表達(dá)。既往研究提示，miR?21在銀屑病皮損區(qū)高表達(dá)，且與細(xì)胞增殖相關(guān)［7，12］。因此我們推測(cè)，甘草次酸對(duì)銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞miR?21表達(dá)的抑制可能與其細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)相關(guān)。然而，既往研究提示，多種miRNA參與銀屑病發(fā)病，如miR?31、miR?103等［8，13］，這些都是銀屑病皮損區(qū)活躍的生物標(biāo)記物，而本研究?jī)H圍繞miR?21展開部分研究，因此，有關(guān)甘草次酸在銀屑病治療中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上，本實(shí)驗(yàn)以甘草次酸作為干預(yù)因素，以銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞為研究對(duì)象，證明甘草次酸抑制銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，此外，甘草次酸明顯抑制了增殖相關(guān)標(biāo)記物miR?21的表達(dá)，為甘草次酸制劑治療銀屑病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。