劉彩霞,周 燕,徐秋芳,*,陳俊輝,秦 華,李永春,梁 雪

1 浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點實驗室,浙江農(nóng)林大學,臨安 311300 2 浙江農(nóng)林大學環(huán)境與資源學院,臨安 311300

毛竹(Phyllostachypubescens) 又稱楠竹,多年生禾本科剛竹屬植物,主要分布在長江以南地區(qū),是我國分布最廣、面積最大的經(jīng)濟竹種。據(jù)第八次全國森林資源清查報告顯示,毛竹面積已達443.01萬hm2,占我國竹林總面積的73.7%[1]。二十世紀八九十年代我國南方地區(qū)開始大規(guī)模推行以施用化肥為主要特征的集約化經(jīng)營,這一措施提高了當?shù)剞r(nóng)民的收入,但長期集約化經(jīng)營也給生態(tài)環(huán)境帶來一系列負面影響。土壤中積累的大量養(yǎng)分元素通過地表徑流、滲濾和淋溶的方式進入地表和地下水,造成農(nóng)業(yè)面源污染[2- 4]。更重要的是不同學者已研究發(fā)現(xiàn)施肥、翻耕等集約化經(jīng)營措施導致了毛竹林土壤三大菌群細菌、真菌和放線菌[5-6]以及某些功能菌群如固氮菌[7]和氨氧化菌[8]群落結(jié)構(gòu)的變化。

土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)顯著影響土壤生態(tài)系統(tǒng)過程和功能的發(fā)揮,特別是地球生物化學碳循環(huán)過程[9]。生物固碳是地球生物化學碳循環(huán)中的重要環(huán)節(jié),自然界中固定CO2的生物主要有植物和自養(yǎng)微生物,其中自養(yǎng)微生物具有極強的環(huán)境適應能力,廣泛存在于草地[10]、森林[11]、水稻土[12],和海洋深處[13]不同的生態(tài)系統(tǒng)中。自養(yǎng)微生物主要通過同化CO2并將其轉(zhuǎn)化為土壤有機碳來調(diào)節(jié)大氣中CO2濃度和提高土壤的碳固定[14],對減緩大氣CO2濃度升高發(fā)揮著不可忽視的作用。自養(yǎng)微生物迄今為止發(fā)現(xiàn)的5條固碳途徑中,卡爾文循環(huán)是自養(yǎng)微生物同化大氣 CO2的主要調(diào)控途徑[15],1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RubisCO)是該過程中的關(guān)鍵酶。自然界存在的不同類型RubisCO,按照其結(jié)構(gòu)、催化性能和對O2的敏感性可分為4種,依次為RubisCOⅠ至RubisCO Ⅳ[16]。cbbL是RubisCOⅠ的編碼基因,且具有高度保守性,已被用于農(nóng)田[14]、草地[10]、湖泊海洋[13],等不同生態(tài)環(huán)境中固碳微生物群落多樣性的研究。

不同學者分別對福建、湖南、江西以及四川等毛竹主產(chǎn)區(qū)的毛竹林生態(tài)系統(tǒng)碳貯量進行估算,證實了毛竹林生態(tài)系統(tǒng)極強的年固碳能力[17-19]。同時發(fā)現(xiàn),毛竹林土壤中貯存的碳量明顯高于毛竹喬木層碳,周國模等[20]利用標準樣方法估算毛竹林生態(tài)系統(tǒng)碳貯量為106.33 t/hm2,其中0—60 cm土壤層碳貯量為71.47 t/hm2,喬木層為30.580 t/hm2,土壤層碳貯量約為喬木層碳貯量2.3倍。近年來關(guān)于毛竹林地上部分固碳作用及毛竹林生態(tài)系統(tǒng)貯碳量已被廣泛研究[21- 22],而土壤微生物在毛竹林生態(tài)系統(tǒng)中的固碳作用卻未見報道。本研究假設,集約經(jīng)營可能對土壤固碳微生物活動產(chǎn)生影響。本研究選取不同集約經(jīng)營歷史的毛竹林地土壤,揭示集約經(jīng)營對毛竹林土壤固碳cbbL基因的豐度和群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響,以期為毛竹林的固碳潛力及可持續(xù)土壤管理提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于浙江省麗水市遂昌縣,介于118°41′—119°30′E,28°13′—18°49′N之間,坡度20—25°,向陽,屬亞熱帶季風氣候區(qū),多年平均氣溫16.8℃,無霜期251 d,降水量1510 mm。母巖為由花崗巖變質(zhì)的片麻巖石,壤土,土壤深厚、疏松,土層厚度大于1 m。1989年之前為竹林管理粗放經(jīng)營,以劈山、墾復為主,不施用任何肥料,毛竹密度為1800株/hm2左右。1989年后陸續(xù)在不同地塊開始實施以施肥翻耕為主的集約經(jīng)營管理,林下基本沒有灌木雜草,毛竹平均密度約3250株/hm2左右。施肥方法為:大量出筍的大年,在6月份留養(yǎng)的新竹葉子完全展開后,在每株毛竹的上方開出環(huán)形溝,施用尿素(或碳銨)450 kg/hm2;2000—2010年期間進行配方施肥,用量為尿素450 kg/hm2,過磷酸鈣380 kg/hm2,氯化鉀75 kg/hm2;2010年之后施用毛竹專用肥(福建中化生產(chǎn))750 kg/hm2和尿素450 kg/hm2。

1.2 樣品采集與處理

于2013年9月,選擇由同一農(nóng)戶經(jīng)營、并位于同一山上,施肥管理措施一致,不同時間開始集約經(jīng)營(主要是施肥和翻耕)以及位于同一山上相鄰未施肥的粗放經(jīng)營毛竹林地,經(jīng)營時間分別為:粗放經(jīng)營(未施肥對照)、2003年、1998年、1993年和1988年,相當于集約時間分別為0 a(記為CK)、10 a、15 a、20 a、25 a,4個時間梯度(處理)。每個年份毛竹林分別選取3個20 m×20 m樣地(即為3個重復),每個樣地采用 5 點取樣法采集表層(0—20 cm)和亞表層(20—40 cm)土壤充分混勻過篩(2 mm)裝入采樣袋。樣品分為2份,1份放到-70 ℃冰箱,經(jīng)冷凍干燥后,供分子生物學研究;另1份于室內(nèi)自然風干后,研磨過篩用于基本理化性質(zhì)分析。

1.3 土壤理化性質(zhì)分析

1.4 土壤固碳微生物分析

1.4.1 土壤固碳功能菌cbbL基因熒光定量PCR

采用PowerSoilTMTotal DNA Isolation Kit試劑盒提取土壤總DNA,稱取0.5 g凍干土樣品,按照說明書進行DNA提取。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳對所提取DNA的效果進行鑒定,并用微量分光光度計測定其濃度和純度。提取后的DNA分裝并保存于-40℃。

采用實時熒光定量PCR(Real-time Quantutative PCR,qPCR)測定固碳功能菌cbbL基因拷貝數(shù),上游引物:K2f[11]5′-ACCA[C/T] CAAGCC[G/C] AAGCT[C/G] GG- 3′,下游引物V2r : 5′-GCCTTC[C/G] AGCTTGCC[C/G] ACC[G/A] C- 3′,得到492 bp—495 bp的擴增產(chǎn)物[24]。使用CFX 96TMReal-Time System(Bio-Rad, USA)儀器對cbbL基因進行熒光定量PCR擴增,每個樣品重復3次。體系組成如下: 2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μL,50 μmol/L上游和下游引物各0.2 μL,模板DNA 1 μL,ddH2O 補水至 20 μL。反應程序參照文獻[24]:95℃預變性 3 min,40個循環(huán)包括95℃ 10s,62℃ 40 s,72℃ 30 s。熒光定量PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后,與pEASY-T3載體連接并轉(zhuǎn)接入大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細胞,在含Ampicillin平板上進行藍白斑篩選陽性克隆,挑選部分陽性克隆子送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序獲得的已知陽性克隆子擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA,用微量分光光度計檢測濃度和純度(OD260/OD280)。重組質(zhì)粒梯度稀釋后8倍作為cbbL基因的熒光定量PCR標準樣品,標準樣品的反應體系和反應程序同上[24]。溶解曲線為單一峰型,說明條件符合要求,引物特異性良好。表層和亞表層土壤擴增效率為96.6%和93.9%,標線R2均大于0.995。

1.4.2 固碳功能菌cbbL基因末端限制性片段長度多態(tài)分析(T-RFLP)

采用T-RFLP技術(shù)分析固碳功能菌群落,引物K2f和V2r[10]。上游引物5′端用FAM熒光標記,反應體系包括Premix 10 μL、10 μmol /L的上游和下游引物各0.2 μL、Bovine Serum Albumin(BSA,20 mg/mL)0.2 μL、DNA模板0.3 μL、ddH2O 補水至50 μL,反應程序[26]:95℃ 預變性3 min,95℃變性1 min,62℃退火1 min,72℃延伸90 s,35個循環(huán),72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后,用限制性內(nèi)切酶MspI在37℃下消化4 h,酶切產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司利用毛細管電泳檢測自動測序分析。將圖譜中±1 bp T-RFs視為一個OTU,當T-RFs的相對豐度>1%時可納入后續(xù)分析;相對豐度>10%被視為優(yōu)勢種群[24]。

1.4.3 固碳功能菌cbbL基因克隆文庫

構(gòu)建固碳功能細菌cbbL基因克隆文庫來確定固碳自養(yǎng)微生物的種類。擴增PCR,引物及反應程序同熒光定量PCR。PCR產(chǎn)物純化后連接到pEASY-T3載體連接并轉(zhuǎn)接入大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細胞,在氨芐青霉素平板進行藍白斑挑選,驗陽挑選200個陽性克隆子送至生工生物工程有限公司(上海)測序。利用DOTUR軟件將相似性大于97%的序列視為同一操作分類單元(Operational Taxonomic Unit, OTU)[25]。分別以NCBI數(shù)據(jù)庫中cbbL基因BLAST結(jié)果相似性大于90%的序列為參比序列[25],利用Clustal X進行多重比對,采用MEGA 5.0 中的Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。所獲得的cbbL基因序列提交至NCBI,序列登錄號為MF430937-MF431023。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007軟件對數(shù)據(jù)進行處理,OriginPro 8軟件作圖,SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。根據(jù)T-RFLP圖譜中OTU的數(shù)目及其豐度通過BIO-DAP程序(http://nhsbig.inhs.uiuc.edu/wes/population.html)計算樣品的多樣性指數(shù)。采用Canoco 4.5軟件(Mocrocomputer Power,Ithaca,USA)對T-RFLP結(jié)果進行冗余分析(RDA)。

2 結(jié)果分析

2.1 毛竹林集約經(jīng)營過程中土壤理化性質(zhì)變化

表1 不同集約經(jīng)營年限毛竹林土壤理化性質(zhì)

CK: 空白對照,Control check; 10 a: 集約經(jīng)營10年;15 a: 集約經(jīng)營10年;20 a: 集約經(jīng)營20年;25 a: 集約經(jīng)營25年;平均值±標準偏差(n=3);同列數(shù)值后不同小寫字母代表同一土層不同經(jīng)營年限的顯著性差異(P<0. 05);除全氮和C∶N比數(shù)據(jù)外,其他指標與何冬華等[7]相同

2.2 毛竹林集約經(jīng)營過程中土壤cbbL基因數(shù)量變化及其與土壤性質(zhì)的關(guān)系

圖1 不同集約經(jīng)營年限毛竹林土壤固碳細菌cbbL基因豐度 Fig.1 Abundance of cbbL gene under long-term intensive managed Phyllostachys pubescens stand大寫字母代表0—20 cm土層不同經(jīng)營年限的顯著性差異(P<0.05);小寫字母代表20—40 cm土層不同經(jīng)營年限的顯著性差異(P<0.05)

2.3 毛竹林集約經(jīng)營過程中土壤固碳細菌結(jié)構(gòu)及物種變化

圖2 不同集約經(jīng)營年限毛竹林土壤固碳細菌cbbL基因T-RFs相對豐度Fig.2 Relative abundance of cbbL T-RFs under long-term intensive managed Phyllostachys pubescens forests T-RFs: 限制性多態(tài)片段,Terminal restriction fragments

擴增的產(chǎn)物經(jīng)MspI酶切處理后,得到40—488 bp之間的T-RFs19條。如圖所示(圖2)其中177 bp是所有表層和亞表層土壤的優(yōu)勢片段(20.70%—45.52%)。第二優(yōu)勢片段40 bp(7.96%—17.79%),隨著集約經(jīng)營時間延長其相對豐度提高,分別在表層和亞表層15 a達到最大值(17.79%和16.57%),在隨后的經(jīng)營年限中又逐漸下降。213 bp與40 bp具有相同的變化規(guī)律,但并未成為優(yōu)勢片段。360 bp與40 bp及213 bp規(guī)律相反,表層和亞表層15 a豐度最低(3.06%和11.77%),它是亞表層的第三優(yōu)勢片段。以上描述的片段出現(xiàn)在所有土壤處理(年限)中,集約經(jīng)營措施只改變其豐度;而有些片段只出現(xiàn)在某1個或幾個集約經(jīng)營年限土壤中,如表層中的49 bp、127 bp、129 bp和亞表層中的362 bp在CK中出現(xiàn),隨著集約經(jīng)營的進行消失,在隨后的經(jīng)營年限土壤中又出現(xiàn);相反表層中的219 bp、364 bp和488 bp與亞表層42 bp、219 bp并未在CK中出現(xiàn),在毛竹林開始集約經(jīng)營后逐漸出現(xiàn);488 bp是表層特有片段,但并非優(yōu)勢片段。說明施肥翻耕對這些片段代表的微生物產(chǎn)生影響。

圖3 基于部分cbbL序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on partial cbbL sequences

本研究挑選200個陽性克隆子測序,基于97%的相似性被分成64個OTU。系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示(圖 3),序列共形成3個未知 Cluster 簇(56%),余下的序列與變形菌門(Proteobacteria)的α-Proteobacteria(11%)和γ-Proteobacteria(6%)以及Actinobacteria(28%)相似度較高。T-RFLP圖譜結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),第一優(yōu)勢T-RF片段177 bp與慢生根瘤菌Bradyrhizobiumottawaense(LT629693.1) 、慢生根瘤菌Bradyrhizobiumicense(CP016428.1)、沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonaspalustris(CP000283.1)、Starkeyanovella(CP002026.1)、高溫單孢菌Thermomonosporacurvata(CP001738.1)和Dokdonellakoreensis(CP015249.1)親緣關(guān)系較近,分布在3個未知 Cluster 簇、α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria簇和Actinobacteria簇上,與來自草地[10]、森林[25]和水稻土[12]的基因序列相似度高。362 bp和36 bp與Thermomonospoacurvata(CP001738.1)親緣關(guān)系較近,分布在Actinobacteria簇上,與來自旱地[26]和草地[10]的基因序列相似度高。175 bp分布在Cluster Ⅲ簇上,同樣與來自旱地[26]和草地[10]的基因序列相似度高。第二優(yōu)勢片段40 bp本研究中雖未克隆到該片段,但已有學者[27]利用與本研究相同的MspI酶研究固碳細菌時發(fā)現(xiàn),(40±1) bp與Bradyrhizobiumottaweanse(LT629693.1)的親緣相似度達76%。

2.4 毛竹集約經(jīng)營過程中cbbL基因多樣性變化

表2 不同經(jīng)營歷史毛竹林土壤固碳微生物多樣性指數(shù)

同列數(shù)值后不同小寫字母代表不同經(jīng)營年限的顯著性差異(P<0. 05)

表3 土壤理化因子與cbbL基因多樣性指數(shù)相關(guān)性分析

*代表相關(guān)性達到顯著水平P<0.05;**代表相關(guān)性達到極顯著水平P<0.01

2.5 環(huán)境因子對土壤固碳微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

以T-RFLP 片段信息和土壤化學性質(zhì)為兩組變量進行冗余分析(RDA)(圖4)。從二維排序軸上可知,表層土壤中CK與集約經(jīng)營10 a、15 a、20 a、25 a樣地在第一排序軸上顯著分開,CK主要分布在第一排序軸正軸上,10 a、15 a、20 a、25 a處理主要分布在第一排序軸負軸上。亞表層土壤中CK與10 a、15 a、20 a樣地固碳細菌群落結(jié)構(gòu)較為接近,在第一排序軸上與25 a分開,CK與10 a、15 a、20 a主要分布在第一排序軸負軸上,25 a主要分布在第一排序軸正軸上。以上結(jié)果說明集約經(jīng)營措施對表層和亞表層土壤固碳細菌的群落結(jié)構(gòu)均有顯著影響。

圖4 毛竹林土壤固碳細菌群落結(jié)構(gòu)的冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of CO2 fixating bacterial community in soils of Phyllostachy spubescens stand

3 討論

以施肥和翻耕為主的集約經(jīng)營顯著影響了毛竹林土壤三大菌群細菌、真菌和放線菌[5-6]以及某些功能菌群如固氮菌[7]和氨氧化菌[8]群落結(jié)構(gòu)的變化。本研究假設,集約經(jīng)營可能同樣對固碳微生物產(chǎn)生影響。T-RFLP 圖譜分析表明,毛竹集約經(jīng)營后某些片段從無到有(表層中的219 bp和364 bp與亞表層42 bp、219 bp),某些片段從有到無、再出現(xiàn)(表層中的49 bp、127 bp、129 bp和亞表層中的175 bp、362 bp),說明毛竹林進行集約經(jīng)營顯著影響固碳細菌群落結(jié)構(gòu)。第一和第二優(yōu)勢片段177 bp和40 bp的相對豐度增加,毛竹林集約經(jīng)營后表層土壤177 bp在亞表層土壤變化不明顯、片段40 bp表現(xiàn)出增加趨勢。從系統(tǒng)發(fā)育可知,優(yōu)勢片段多為兼性自養(yǎng)細菌,與Tolli等[11]報道的松林和旱地的兼性自養(yǎng)細菌大于專性自養(yǎng)細菌的結(jié)論相類似。袁紅朝等[28]在研究施肥對固碳功能菌群落結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn),長期施肥使硫桿菌,亞硝化螺菌(嚴格自養(yǎng)菌)等種群優(yōu)勢明顯降低,而產(chǎn)堿桿菌(兼性自養(yǎng)菌)優(yōu)勢度上升。固碳自養(yǎng)細菌按能量來源可分為光能型和化能型,Wu 等[29]的研究顯示光照主要影響表層1 cm左右的碳同化自養(yǎng)微生物。而兼性自養(yǎng)細菌則能夠利用除有機化合物外更廣的能量,如銨鹽、亞硝酸、硫、硫化氫等無化合物,在光源不足的土層中保證其正常的生長代謝,因此其成為優(yōu)勢種群。

4 結(jié)論

本研究表明,長期集約經(jīng)營顯著提高了毛竹林表層和亞表層土壤的養(yǎng)分含量、降低土壤pH 值。集約經(jīng)營毛竹林土壤固碳微生物數(shù)量并未表現(xiàn)出與SOC的相關(guān)性,而與N素水平的變化顯著相關(guān)。具體表現(xiàn)為:隨著集約經(jīng)營的進行表層土壤cbbL基因豐度呈先上升后下降的規(guī)律,與氮素水平呈正相關(guān);亞表層土壤cbbL基因豐度則呈直線下降趨勢,與C∶N比呈正相關(guān)。集約經(jīng)營導致表層和亞表層土壤微生物群落結(jié)構(gòu)改變、表層固碳細菌多樣性指數(shù)下降。系統(tǒng)發(fā)育分析表明,不可培養(yǎng)固碳細菌占56%比例,土壤中具有共同的優(yōu)勢種類多為變形菌和放線菌,以兼性自養(yǎng)為主。RDA分析結(jié)果表明土壤酸化和養(yǎng)分積累是毛竹林土壤固碳細菌群落和多樣性變化的重要原因。