周家喜,喻理飛,張 健,張曉敏,胡大鳴,歐明毅,鄒 曉,*

1 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生態(tài)系,貴陽 550025 2 貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,貴陽 550001

煙葉陳化是指在人工可控的倉儲環(huán)境下煙葉與微生物及環(huán)境相互作用的發(fā)酵過程,在此過程中,倉儲環(huán)境因子(溫度、濕度等)、煙葉化學(xué)組分(總糖、蛋白質(zhì)、淀粉、生物酶等)含量、煙葉水分及酸堿度等與煙葉表面微生物彼此聯(lián)系、互相促進(jìn)、互相制約共同構(gòu)成了煙葉陳化的特定生態(tài)系統(tǒng),并在物質(zhì)流、能量流和基因流“三流運(yùn)轉(zhuǎn)”規(guī)律的交互作用下構(gòu)成了煙葉微生態(tài)的動態(tài)發(fā)展和特定階段的動態(tài)平衡[1]。環(huán)境信息的傳遞和煙葉化學(xué)物質(zhì)的改變直接或間接的影響著煙葉微生物的種類和數(shù)量及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與積累,并最終決定著物質(zhì)和能量的走向[2-3],因此,研究倉儲生態(tài)因子和煙葉化學(xué)成分的改變對煙葉微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的影響具有重要意義。隨著煙葉陳化的不斷進(jìn)行,微生物群落的消長演替又會引起煙葉組分微環(huán)境的變化[4],如蛋白質(zhì)、淀粉、糖類、纖維素等大分子物質(zhì)降解[5-6]及紫羅蘭酮、大馬酮、糠醛等小分子物質(zhì)產(chǎn)生[7-8]。環(huán)境因子變化也會作用于微生物,并導(dǎo)致群落結(jié)構(gòu)及代謝產(chǎn)物的成分和比例發(fā)生變化,最終形成產(chǎn)品特有的生態(tài)風(fēng)味[9],所以,研究微生物群落動態(tài)變化對了解煙葉陳化生態(tài)系統(tǒng)的運(yùn)行很有必要。

煙葉陳化過程中占優(yōu)勢的微生物群落以細(xì)菌類為主[10],但是目前90%—99%的微生物處于不可培養(yǎng)狀態(tài)[11],因此本研究依托二代測序的技術(shù)優(yōu)勢[12]對樣品中微生物菌群進(jìn)行分析,同時(shí)結(jié)合分析陳化過程中煙葉化學(xué)組分的變化,揭示細(xì)菌群落變化過程與煙葉化學(xué)組分之間作用規(guī)律,加深對煙葉陳化機(jī)制的理解。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品：分別陳化了0、6、12、18、24個(gè)月的云南保山C3F煙葉樣品(產(chǎn)地：云南保山地區(qū)；品種：云87；等級：C3F)；采集地：貴陽庫(GY)、壇廠庫(TC)、紫云庫(ZY)；采集方式：除去煙箱表層煙葉,按五點(diǎn)式收集煙葉樣品,500g,存于-20℃冰箱中,各庫樣品同一時(shí)間內(nèi)采集；采集時(shí)間：2014年7月、2015年1月、2015年7月、2016年1月、2016年7月；編號：GY-0、TC-0、ZY-0、GY- 6、TC- 6、ZY- 6、GY- 12、TC- 12、ZY- 12、GY- 18、TC- 18、ZY- 18、GY- 24、TC- 24、ZY- 24。

1.2 方法

1.2.1 煙葉微生物收集與總DNA提取

參照Zhao等[13]和Su等[14]的網(wǎng)膜法收集煙葉總微生物。稱取60g煙葉樣品,剪碎,平均分成3份,分別置于3個(gè)裝有200mL pH=7.0磷酸緩沖溶液(PBS)的三角瓶中,27℃、200r/min震蕩培養(yǎng)1h；用已滅菌的雙層紗布過濾培養(yǎng)物,收集濾液；6000r/min室溫離心30min,收集沉淀；加入20mL PBS緩沖液,重新制成菌懸液,6000r/min離心,收集沉淀,最后將相同樣品的沉淀物匯集到一起,即為煙葉總微生物。參照OMEGA公司E.Z.N.A.? SoiL DNA Kit試劑盒說明方法提取微生物總DNA。提取的總DNA送北京諾和致源科技股份有限公司進(jìn)行高通量測序。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及高通量測序

選取16S rRNA基因 V4片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物使用HiSeq2500 PE250進(jìn)行上機(jī)測序。選用引物：515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA- 3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)。反應(yīng)體系(30μL)：Phusion Master Mix(2×) 15μL；Primer1(2μmol/L)1.5μL；Primer2(2μmol/L)1.5μL；DNA模板(1ng/μL)10μL；H2O 2μL。反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性1min；98℃ 10s,50℃ 30s,72℃ 5min,共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。

1.2.3 化學(xué)物質(zhì)檢測

參照李永忠等[15]方法進(jìn)行煙葉常規(guī)化學(xué)物質(zhì)檢測,每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。有機(jī)碳采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化容量法；全氮采用H2SO4-H2O2消化-蒸餾法；全磷采用H2SO4-H2O2消化-鉬黃比色法；全鉀采用H2SO4-H2O2消化-火焰分光光度法；水溶性總糖采用80%酒精浸提-蒽酮比色法；煙堿采用堿蒸餾-紫外分光光度法；淀粉采用稀酸水解-蒽酮比色法；蛋白質(zhì)采用凱氏定氮法；粗纖維采用酸堿洗滌-重量法；石油醚浸提物采用石油醚浸提-重量法。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

①序列處理及OTU注釋：根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù),截去Barcode和引物序列后使用FLASH[16]對每個(gè)樣品的Reads進(jìn)行拼接,得到原始Tags數(shù)據(jù)；參照Qiime[17]的Tags質(zhì)量控制流程,經(jīng)過Tags截取、過濾及嵌合體去除等處理后得到高質(zhì)量的有效Tags數(shù)據(jù)。利用Uparse軟件,以97%的一致性將序列聚類為OTUs(Operational Taxonomic Units),選取OTUs的代表性序列用Mothur方法與SSU rRNA數(shù)據(jù)庫對OTUs進(jìn)行物種注釋,并在OTU水平上進(jìn)行α多樣性分析。

②細(xì)菌群落動態(tài)變化分析：通過韋恩圖分析陳化不同時(shí)間的樣品OTUs分布差異；根據(jù)所有樣品在屬水平的物種注釋及豐度信息,選取豐度排名前35的類群,從物種和樣品兩個(gè)層面進(jìn)行聚類,繪制成熱圖,分析不同陳化時(shí)間樣品優(yōu)勢細(xì)菌類群變化情況；通過LEfSe系統(tǒng)分析不同陳化時(shí)間的樣品間顯著差異的物種。

③細(xì)菌群落變化與化學(xué)成分關(guān)系分析：結(jié)合不同陳化時(shí)間優(yōu)勢細(xì)菌及關(guān)鍵類群,利用SPSS 19.0、CANOCO 5等統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對細(xì)菌群落與各化學(xué)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析和冗余分析(RDA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序結(jié)果

圖1 Shannon-Winner指數(shù)曲線Fig.1 The Shannon-Winner curves GY：貴陽庫；TC：壇廠庫；ZY：紫云庫；0、6、12、18、24：陳化時(shí)間,0個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月

Shannon-Winner指數(shù)曲線可反映各樣本的物種多樣性隨測序量的變化情況[18]。如圖1所示,隨著樣品序列數(shù)的增加,Shannon-Winner指數(shù)曲線越趨向平坦,表明本試驗(yàn)測序的數(shù)據(jù)深度能較全面地反應(yīng)測序樣品中微生物信息。

樣品DNA高通量測序結(jié)果如表1所示,經(jīng)拼接、優(yōu)化、過濾后得到1191887條有效序列,每個(gè)樣品得67940—86235條；以97%的一致性將序列聚類,平均得到1099個(gè)OTU。對不同樣品的α多樣性指數(shù)進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn),樣品細(xì)菌豐富度的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)分別在510.34—3528.94和520.33—2226.74之間。反映菌群多樣性的Shannon和Simpson值分別達(dá)到3.47—6.59和0.70—0.96。其中,樣品GY-0細(xì)菌最豐富,多樣性最大,Shannon指數(shù)達(dá)6.59,樣品ZY- 18多樣性最低,Shannon指數(shù)為3.47；樣品GY- 24和TC-0均勻性最好,Simpson指數(shù)均達(dá)到0.97,ZY- 18均勻性最差,Simpson指數(shù)為0.70。所有樣品Coverage指數(shù)均達(dá)到0.98以上,表明本次研究所測得的數(shù)據(jù)足夠反應(yīng)煙葉細(xì)菌群落的多樣性。

表1 樣品測序結(jié)果及α多樣性指數(shù)信息

GY：貴陽庫；TC：壇廠庫；ZY：紫云庫；0、6、12、18、24：陳化時(shí)間,0個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月、24個(gè)月

2.2 細(xì)菌群落組成

煙葉細(xì)菌種類豐富,分屬于493個(gè)屬,每個(gè)樣品相對豐度大于1.0%的類群組成,如圖2所示(< 1.0%的歸于Others)。假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、芽孢桿菌屬為主要優(yōu)勢類群,其中,假單胞菌屬占主導(dǎo)優(yōu)勢,占17.8%—44.3%,其次是鞘氨醇單胞菌屬,占8.0%—23.6%。

圖2 屬水平上相對豐度柱狀圖Fig.2 Histogram of relative abundance at the genus level

2.3 不同陳化時(shí)間煙葉細(xì)菌群落動態(tài)演替分析

2.3.1 OTU變化分析

在OTU水平上繪制韋恩圖,如圖3所示。貴陽庫(圖3A)樣品有313個(gè)共有OTUs,陳化0、6、12、18、24個(gè)月時(shí)分別有267、110、90、120、159個(gè)特有OTUs。壇廠庫(圖3B)樣品有170個(gè)共有OTUs,陳化0、6、12、18、24個(gè)月時(shí)分別有249、82、126、115、262個(gè)特有OTUs。紫云庫(圖3C)樣品有176個(gè)共有OTUs,陳化0、6、12、18、24個(gè)月時(shí)分別有192、97、140、41、264個(gè)特有OTUs。共有的OTUs表明這些細(xì)菌類群的作用在煙葉陳化過程中貫穿于陳化的始終,是煙葉陳化的主要細(xì)菌類群；不同陳化階段特有OTUs表明煙葉陳化過程中功能細(xì)菌群落與陳化進(jìn)程密切相關(guān),演替現(xiàn)象明顯。

圖3 不同陳化時(shí)間樣品OTUs韋恩圖Fig.3 Analysis of OTUs from samples of different aging time via Venn diagram圖A：貴陽庫樣品OTUs；圖B：壇廠庫樣品OTUs；圖C：紫云庫樣品OTUs

2.3.2 優(yōu)勢細(xì)菌類群變化分析

針對陳化不同時(shí)間對所有樣品進(jìn)行組合分析,發(fā)現(xiàn)煙葉細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)隨陳化時(shí)間的延長發(fā)生了較大變化(圖4)。陳化開始時(shí)擬桿菌門的Sphingobacterium,變形菌門的Steroidobacter、Aquicella、Legionella、Pseudoxanthomonas、Methylobacterium及厚壁菌門的Romboutsia等類群占優(yōu)勢。6個(gè)月時(shí)變形菌門的Pusillimonas和Vulgatibacter占優(yōu)勢。12個(gè)月時(shí)綠彎菌門的unidentified_Anaerolineaceae占優(yōu)勢。18個(gè)月時(shí),所有類群的豐度都相對較低,變形菌門的Pusillimonas占優(yōu)勢。24個(gè)月時(shí),變形菌門的Stenotrophomonas和Comamonas,厚壁菌門的Solibacillus、Bacillus、Staphylococcus、Paenibacillus及放線菌門的Kocuria等類群優(yōu)勢明顯。

整體來看,隨著煙葉陳化時(shí)間的增加,細(xì)菌優(yōu)勢類群種類先減少后增加,其中變形菌類逐漸減少,厚壁菌類和放線菌類逐漸增加,這種變化與李曉強(qiáng)研究結(jié)果相似[19]。

圖4 不同陳化時(shí)間樣品物種豐度聚類熱圖Fig.4 Heatmap of species abundance for samples of different aging time

2.3.3 關(guān)鍵細(xì)菌類群變化分析

通過LEfSe分析(LDA 值默認(rèn)為4)發(fā)現(xiàn),在煙葉陳化0、12、24個(gè)月時(shí)樣品之間具有顯著差異的細(xì)菌類群,結(jié)果如圖5所示。陳化開始時(shí)Methylobacterium差異顯著,起重要作用。陳化12個(gè)月時(shí) Enterobacteriaceae起重要作用。陳化24個(gè)月時(shí)Bacillus、Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas差異明顯,發(fā)揮重要作用。LEfSe分析表明隨煙葉陳化時(shí)間延長,關(guān)鍵優(yōu)勢菌群發(fā)生一系列演變,先是由Methylobacterium向Enterobacteriaceae演變,隨后向Bacillus、Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas變化。其中,Methylobacterium、Sphingomonas、Comamonas、Pseudomonas、Enterobacteriaceae均屬于變形菌門類群,Bacillus屬于厚壁菌門類群,因此,隨陳化時(shí)間延長,厚壁菌門優(yōu)勢逐漸增加,芽孢桿菌優(yōu)勢度后期明顯增強(qiáng)。

圖5 不同陳化時(shí)間物種LDA值分布柱狀圖Fig.5 The LDA score distribution histogram of LEfSe analysis in different aging time

2.4 細(xì)菌群落演替與煙葉化學(xué)成分的關(guān)系

RDA分析結(jié)果中,軸1和軸2累積變量分別為50.70%和73.24%,化學(xué)物質(zhì)變化對細(xì)菌群落演替整體解釋量為78.90%。據(jù)圖6和表2可知,水溶性總糖對細(xì)菌群落動態(tài)影響最大,其次是纖維素。陳化開始時(shí)(Ⅰ),水溶性總糖貢獻(xiàn)最大,與Pusillimonas顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.546,與Steroidobacter、Romboutsia、Clostridium_sensu_stricto_1、Legionella顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.613、0.613、0.656、0.517。陳化12個(gè)月時(shí)(Ⅱ),淀粉、石油醚浸提物及總氮、總磷等影響最大,石油醚浸提物與Xanthomonas呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.541,與Pusillimonas、Vulgatibacter呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.579、0.524；總磷與Xanthomonas呈顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.528。陳化24個(gè)月時(shí)(Ⅲ),纖維素作用最明顯,與Staphylococcus、Aureimonas、Massilia呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.562、0.539、0.528。隨著時(shí)間的延長,細(xì)菌群落發(fā)生了由降解糖類向降解淀粉類菌群變化,再向降解纖維素類菌群變化的演替現(xiàn)象,這與化合物的逐級降解相關(guān)。

圖6 優(yōu)勢細(xì)菌群落與化學(xué)物質(zhì)RDA分析Fig.6 Redundancy analysis based on bacterial community and chemical substanceb1—b24：假單胞菌屬Pseudomonas、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas、芽孢桿菌屬Bacillus、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、叢毛單胞菌屬Comamonas、甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium、葡萄球菌屬Staphylococcus、Aureimonas、黃單胞菌屬Xanthomonas、馬賽菌屬M(fèi)assilia、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、極小單胞菌屬Pusillimonas、Steroidobacter、unidentified_Anaerolineaceae、土壤芽孢桿菌屬Solibacillus、Romboutsia、鞘脂桿菌屬Sphingobacterium、庫克菌屬Kocuria、Clostridium_sensu_stricto_1、Vulgatibacter、軍團(tuán)菌屬Legionella、Aquicella、假黃色單孢菌屬Pseudoxanthomonas、腸桿菌科Enterobacteriaceae

3 討論

煙葉陳化是在環(huán)境可控的人工倉儲設(shè)施內(nèi)進(jìn)行的自然發(fā)酵過程。在此過程中煙葉不僅為復(fù)雜的微生物體系提供了棲息地和營養(yǎng)物質(zhì),還為微生物活動提供多樣的生態(tài)位,以維持陳化生態(tài)系統(tǒng)的正常運(yùn)行；反之,微生物在滿足自身生長繁殖的同時(shí),分泌各種生物酶分解有機(jī)大分子物質(zhì),促進(jìn)煙葉的陳化進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)煙葉表面細(xì)菌物種豐富,以假單胞菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬、芽孢桿菌屬等為優(yōu)勢類群,這與前人研究結(jié)果相似[20-21]。近年來發(fā)現(xiàn)許多假單胞菌菌株能高效降解煙葉尼古丁[22]；部分芽孢桿菌能分泌蛋白酶、淀粉酶等多種生物酶,促進(jìn)煙葉大分子物質(zhì)降解[6]；鞘氨醇單胞菌是降解芳香化合物的新型生物資源[23],對煙葉芳香類化合物的降解具有廣泛應(yīng)用前景。因此,煙葉陳化是多種微生物協(xié)同作用的結(jié)果,微生物是陳化的主要驅(qū)動因子。

煙葉陳化是一個(gè)微型動態(tài)過程,早期研究表明隨陳化時(shí)間的延長,煙葉表面細(xì)菌數(shù)量、種類及多樣性后期明顯呈下降趨勢[24-25],但對于具體菌群的變化還不明確。本研究結(jié)果表明,隨陳化時(shí)間的增加,細(xì)菌群落消長演替,優(yōu)勢細(xì)菌類群不斷變化,由變形菌門向厚壁菌門演變,芽孢桿菌后期作用顯著。目前對于煙葉陳化過程中微生物群落變化主要有兩種解釋：第一種觀點(diǎn)認(rèn)為是陳化環(huán)境條件決定了煙葉上微生物的豐度和種類及其演化過程。Di Giacomo等研究人員認(rèn)為,環(huán)境溫度和pH是促進(jìn)微生物動態(tài)演替的主要?jiǎng)恿χ籟4]。浦紹占等在研究云南玉溪紅塔區(qū)和元江縣兩倉庫中不同自然陳化時(shí)期的紅大品種烤煙表面微生物種群結(jié)構(gòu)時(shí),發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期、不同地點(diǎn)陳化煙葉表面細(xì)菌的優(yōu)勢種群不盡相同[3]。Chopyk等比較了在室溫、冰箱、人的口袋三種不同儲存條件下五種不同品牌香煙制品細(xì)菌群落組成及動態(tài)變化,發(fā)現(xiàn)香煙品種對煙葉細(xì)菌群落影響不大,而儲存條件對煙葉微生物豐度及動態(tài)變化影響較大[26]。這主要是由于不同的儲存地或儲存方式中環(huán)境溫度、濕度、pH及其他生態(tài)因子的不同而導(dǎo)致煙葉表面微生物群落結(jié)構(gòu)的差異。第二種觀點(diǎn)認(rèn)為是由于化學(xué)成分的改變而引起煙葉微生物群落的改變。葉建斌等曾推測在原煙進(jìn)入陳化階段后,由于培養(yǎng)成分的改變,適者生存,不適者淘汰,從而形成了新的微生物群落結(jié)構(gòu)[27],但他們沒有對該推測進(jìn)行驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)(表2)在煙葉陳化開始時(shí),水溶性總糖的影響較大,與優(yōu)勢菌群甲基桿菌類呈正相關(guān)關(guān)系；12個(gè)月時(shí),淀粉、石油醚浸提物及總磷、總氮等的影響較大,與腸桿菌類呈正相關(guān)關(guān)系；24個(gè)月時(shí),纖維素是影響的主要因素,與芽孢桿菌類、鞘氨醇單胞菌類、叢毛單胞菌類、假單胞菌類等優(yōu)勢菌群呈正相關(guān)關(guān)系。本研究還發(fā)現(xiàn)細(xì)菌間的銜接與煙葉有機(jī)質(zhì)的逐級降解相關(guān)聯(lián)(圖6),前期主要是以能降解糖類和淀粉的微生物為主,后期主要是以能降解纖維素和木質(zhì)素的微生物為主。這充分證實(shí)了化學(xué)成分的改變是微生物群落演替變化的主要?jiǎng)恿χ弧?/p>

表2 細(xì)菌群落變化與煙葉化學(xué)成分相關(guān)性分析

*在0.05水平相關(guān)性顯著,**在0.05水平上相關(guān)性極顯著

在煙葉陳化生態(tài)系統(tǒng)中,陳化是在微生物的驅(qū)動下進(jìn)行的,而煙葉的陳化伴隨著微生物的演替,微生物的演替受陳化環(huán)境和化學(xué)成分的共同驅(qū)動。通過對煙葉微生物群落組成、群落演替分析,可以確定最優(yōu)的微生物群落組成,對微生物群落變化與化學(xué)成分關(guān)系分析,有助于煙葉陳化進(jìn)程的人工調(diào)控。