李明，武志兵，楊永強，王文成，侯燕紅，劉學(xué)敏

長治醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，山西長治 046000

早期的神經(jīng)科學(xué)研究認為，哺乳動物自出生后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育已處于完成狀態(tài)，不存在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)再生的現(xiàn)象[1]。然而隨著神經(jīng)科學(xué)研究技術(shù)和手段的不斷更新進步，科學(xué)家在對3H-thymidine和BrdU的應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn)哺乳動物在出生后在其腦組織的一些部位仍然存在著活躍的神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)再生現(xiàn)象，這些部位集中位于海馬、齒狀回、室管膜下區(qū)和腦皮層這些部位，在這些部位陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了新生的未成熟的神經(jīng)元[2]。DCX（doublecortin）是近些年來發(fā)現(xiàn)的一種與神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元遷移有關(guān)的微管相關(guān)蛋白，在哺乳動物的胚胎腦神經(jīng)發(fā)育和出生后神經(jīng)發(fā)育過程中，該蛋白對于不成熟神經(jīng)元的定向遷移具有重要的作用[3]，DCX的表達具有一定的特異性，表達于處于發(fā)育階段的未成熟神經(jīng)元，尤其在處于遷移狀態(tài)的未成熟神經(jīng)元表達明顯，但隨著未成熟神經(jīng)細胞的不斷分化成熟，DCX的表達呈下調(diào)趨勢。所以DCX作為檢測未成熟神經(jīng)元的重要標(biāo)記物，在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)再生的研究中具有較強的特異性研究價值[4]。該研究于2016年7—2017年4月選取出生后15 d幼犬4只作為研究對象，觀察了DCX在哺乳動物出生后早期腦組織的表達分布情況，旨在探討哺乳動物出生后早期神經(jīng)發(fā)育的機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物處理

選取出生后15 d的普通哺乳動物家犬4只為實驗對象，實驗動物由本院實驗動物中心提供。實驗動物中心懷孕母犬室溫飼養(yǎng)，分娩后的幼犬給予母乳加正常飲食15 d，選取健康幼犬4只，腹腔注射麻醉劑水合氯醛（0.4 mL/100 g）實施動物麻醉，動物麻醉好后迅速解剖開胸腔，左心室穿刺插管至升主動脈，開放點滴灌注生理鹽水1 000～1500 mL，后灌注4%的多聚甲醛700 mL，取腦后放置于多聚甲醛溶液固定2 d，將后固定好的犬腦在15%～30%的蔗糖溶液中梯度脫水。用包埋劑將脫水后的腦組織包埋后置于低溫冰箱保存8 h。把冷凍好的犬腦冠狀位冰凍切片，切片厚度為15 μm，將組織切片置于抗凍液中低溫冰箱保存待用。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

主要實驗試劑儀器：DCX抗體（羊抗，ab113435，Sigma公司），生物素化二抗 （ab6785，Sigm公司），ABC 試劑（PK-4000，Vector公司），顯色劑 DAB（二氨基聯(lián)苯胺，Vector公司），無水乙醇和H2O2（154525,161874，湖南師范大學(xué)試劑廠），多聚甲醛和二甲苯（152346,165224，上海國藥集團），冰凍切片機（LEICA，德國），光學(xué)顯微鏡（Olymbus E53，日本）。

實驗方法：取出已保存的冰凍切片室溫下靜置1 h，選取帶有齒狀回切片3～5片，于PBS緩沖液中充分漂洗3次，10 min/次，后把切片放入含1%H2O2的PBS溶液中處理30 min，然后再次洗片3次。接著再將切片放入含有5%的馬血清PBS溶液中室溫孵育1 h；添加 DCX 抗體（羊抗，濃度 1：1 000）室溫 1 h，然后4℃冰箱過夜。第2日取出反應(yīng)盒室溫靜置1～2 h，漂洗切片3次后，添加生物素化二抗（濃度1：400）室溫孵育2 h；切片充分漂洗3次后加ABC試劑室溫孵育2 h，再次充分洗片后，添加含有顯色增強劑的0.05%DAB顯色劑顯色；在顯微鏡下控制嚴格顯色時間，顯色符合要求后加PBS終止顯色；充分漂洗后明膠玻片貼片，乙醇濃度梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，待鏡檢。

1.3 顯微鏡下檢測計數(shù)及圖像處理

光學(xué)纖維鏡下分別對幼犬腦組織腦皮層、白質(zhì)、室管膜下區(qū)、海馬和齒狀回進行觀測，觀察DCX在各觀測區(qū)的分布表達情況，同時使用圖像采集系統(tǒng)采集圖像；10×20倍光鏡下觀測計數(shù)各觀測點的陽性細胞表達數(shù)及細胞形態(tài)，每個觀測區(qū)選取6個視野觀測計數(shù)；采集的圖片使用軟件Photoshop 9.0進行處理。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，觀測數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差（±s）表示，進行t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 微管相關(guān)蛋白在腦各觀測區(qū)的表達情況

腦皮層的表達分布情況：在腦皮層中除I層外，均有DCX陽性表達，細胞形態(tài)呈典型神經(jīng)元形態(tài)，細胞突較長且染色明顯，突起伸展方向基本一致，與腦皮層垂直。腦皮層I層未能觀測到陽性表達，II表達明顯，圍繞皮層呈現(xiàn)連續(xù)線狀分布狀態(tài)，細胞突起較長，可見部分突起伸展至I層內(nèi)（圖1中A和B，圖中箭頭指示神經(jīng)元長的突起）。II層下陽性細胞散在分布，不及II層內(nèi)的細胞分布規(guī)律，突起伸展方向亦與腦表面垂直；室管膜下區(qū)的表達分布情況：室管膜下區(qū)為神經(jīng)生發(fā)區(qū)，圍繞著室管膜觀測到DCX的強陽性表達，越靠近室管膜陽性細胞表達越密集分布，近室管膜處細胞突起相對較短，但相互交錯分布，深層陽性表達細胞相對稀疏，但神經(jīng)元突起較長，朝向基本一致，成簇狀分布。近室管膜區(qū)白質(zhì)中可觀測到成簇分布的陽性細胞群，群中的未成熟神經(jīng)元突起方向基本一致，形成神經(jīng)遷移流，（圖1中C和E，箭頭指示為成簇分布的遷移神經(jīng)元群）；海馬表達情況：在海馬區(qū)陽性細胞較少，表達相對較弱，陽性細胞呈現(xiàn)線狀分布，突起明顯染色且長軸與海馬細胞層相垂直，海馬區(qū)的未成熟神經(jīng)元源自齒狀回神經(jīng)生發(fā)區(qū)，通過遷移最終定位于海馬細胞層 （圖1中D）；白質(zhì)表達情況：在白質(zhì)中靠近室管膜下區(qū)有成簇分布的陽性細胞表達，越靠近腦皮層，陽性細胞表達呈現(xiàn)下降趨勢，成簇的陽性細胞形成神經(jīng)元遷移流，新生神經(jīng)元不斷離開遷移流在白質(zhì)中遷移分化，最終定位成熟于皮層（圖1中C和E）；齒狀回表達情況：齒狀回顆粒下層觀測到濃染的陽性細胞表達，陽性細胞密度較大，呈線狀分布，為神經(jīng)生發(fā)區(qū)之一。陽性細胞體整齊排列，相互間距離較小，一側(cè)細胞突起較長且朝向一致，呈發(fā)射狀伸入顆粒細胞層（圖1中F）。

圖1 DCX在幼犬腦各區(qū)的表達（A和B：DCX在腦皮層的表達；C和E：DCX在室管膜下區(qū)及白質(zhì)的表達；D和F：DCX分別在海馬和齒狀回的表達。CS：腦溝 SR：室管膜下區(qū) LV：側(cè)腦室 SGZ：齒狀回顆粒下層）

2.2 各觀測區(qū)陽性細胞計數(shù)結(jié)果

室管膜下區(qū)陽性細胞表達最高，與腦皮層、白質(zhì)和海馬差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），齒狀回顆粒下層陽性細胞表達較高，與皮層、白質(zhì)和海馬差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。 見表1。

表1 陽性細胞在各觀測區(qū)比較（±s）

表1 陽性細胞在各觀測區(qū)比較（±s）

注：與齒狀回比較，aP＞0.05，bP＜0.05；與室管膜下區(qū)比較，bP＜0.05。

觀測區(qū)陽性細胞計數(shù)齒狀回顆粒下層室管膜下區(qū)腦皮層腦白質(zhì)海馬2 9.7 0±2.1 4（2 7.3 0±2.4 1）a（1 2.0 0±1.3 2）b（1 8.5 0±1.8 8）b（6.8 3±1.1 8）b

3 討論

該實驗以幼犬作為實驗研究對象，重點觀測了室管膜下區(qū)、腦皮層、海馬、齒狀回等部位的DCX表達分布情況，其中室管膜下區(qū)和齒狀回DCX表達最高[室管膜下區(qū)陽性細胞：（27.30±2.41），齒狀回陽性細胞：（29.70±2.14）]， 室管膜側(cè)壁下層觀測到密集的陽性表達，細胞突起不明顯，在室管膜下區(qū)白質(zhì)中觀測到神經(jīng)細胞密集分布的神經(jīng)遷移流 [陽性細胞：（18.50±1.88）]，新生神經(jīng)元前導(dǎo)突起伸展方向基本一致，朝向白質(zhì)。齒狀回觀測到濃染的新生神經(jīng)元，一側(cè)神經(jīng)元突起明顯，伸入分子層。說明哺乳動物在出生后早期其腦內(nèi)仍有活躍的神經(jīng)發(fā)育現(xiàn)象存在，神經(jīng)生發(fā)區(qū)位于室管膜下區(qū)和齒狀回，哺乳動物的神經(jīng)發(fā)育在胚胎時期仍未完成，出生后神經(jīng)發(fā)育處于持續(xù)狀態(tài)。與其他學(xué)者在對成年大鼠的神經(jīng)元前體細胞研究結(jié)果比較[5]，該研究發(fā)現(xiàn)大鼠神經(jīng)前體細胞標(biāo)記物DCX主要分布在室管膜下區(qū)、齒狀回顆粒下層、吻側(cè)遷移流和嗅球，其中室管膜下區(qū)DCX陽性細胞密度最高[陽性細胞：（20.45±3.74）]，在吻側(cè)遷移流中陽性細胞[陽性細胞：（15.47±3.64）]排列有序，神經(jīng)細胞前導(dǎo)突起方向基本一致，在齒狀回顆粒下層中陽性細胞[陽性細胞：（18.83±4.35）]表達與室管膜下區(qū)表達相近，未成熟神經(jīng)元前導(dǎo)突起單側(cè)一致朝向分子層，嗅球中觀測到大量的新生神經(jīng)元 [陽性細胞：（19.79±7.24）]離開神經(jīng)遷移流，向嗅球皮層遷移。該實驗研究未觀測嗅球的表達情況，其余觀測區(qū)結(jié)果與成年大鼠觀測區(qū)觀測結(jié)果比較，幼犬觀測區(qū)陽性細胞數(shù)量略偏高，是由于本實驗使用的動物為出生后早期的哺乳動物，出生后早期神經(jīng)發(fā)育處于較為旺盛的階段，而上述學(xué)者采用的實驗動物為成年大鼠，成年大鼠的神經(jīng)再生在成年階段神經(jīng)發(fā)育處于完結(jié)狀態(tài)，即為成年“保持”狀態(tài)，但就神經(jīng)再生的生發(fā)區(qū)而言，成年大鼠和幼犬的室管膜下區(qū)和齒狀回都保持有旺盛的神經(jīng)再生功能，大鼠腦組織神經(jīng)發(fā)育研究結(jié)果與該實驗研究結(jié)果基本一致。成年大鼠的研究中未提及腦皮層II中有陽性細胞表達，是由于成年大鼠腦皮層II中不存在未成熟神經(jīng)細胞，該結(jié)果的差異是由于實驗動物的種屬選擇不同造成的。該實驗研究中實驗動物為幼犬，在其腦皮層II層中明確觀測到呈線狀排列的未成熟神經(jīng)元[陽性細胞：（12.00±1.32）]，神經(jīng)細胞突起明顯并伸展至皮層I層，有的學(xué)者認為該部位也是神經(jīng)生發(fā)區(qū)之一，但該區(qū)是否是神經(jīng)生發(fā)區(qū)諸多學(xué)者間仍存在分歧[6]。所以幼犬完全可作為神經(jīng)發(fā)育研究的實驗動物的理想選擇。

近數(shù)十年的研究表明哺乳動物在出生后其腦內(nèi)存在著一些區(qū)域，這些區(qū)域仍然存在著較為旺盛的神經(jīng)生發(fā)功能，隨著年齡的增長該功能呈現(xiàn)下調(diào)趨勢[7]。哺乳動物在生活期間受到外界刺激或腦組織受到外傷后，這些區(qū)域的功能將會再次被激活上調(diào)，表現(xiàn)為神經(jīng)再生功能，該功能是哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的功能儲備[8]。這些特定的腦功能區(qū)集中于室管膜下區(qū)（SVZ）和齒狀回顆粒下層（SGZ），實驗表明這些區(qū)域終身存在具有增殖功能的神經(jīng)前體細胞。其中室管膜下區(qū)存在有大量的神經(jīng)前體細胞，是重要的神經(jīng)生發(fā)區(qū)之一，該區(qū)域產(chǎn)生的未成熟神經(jīng)細胞群形成吻側(cè)遷移流（RMS）在遷移的過程中不斷分化，遷移至哺乳動物嗅球，然后離開遷移流再遷移至嗅球皮層，分化成為中間神經(jīng)元[9]。楊樹旭等[10]學(xué)者在研究腦出血對DCX表達影響的研究中觀測到：基底節(jié)腦出血動物模型中，與對照側(cè)比較，DCX陽性細胞首先表達于室管膜下區(qū)，并且靠近出血側(cè)神經(jīng)干細胞增殖明顯，反而在神經(jīng)生發(fā)區(qū)齒狀回未檢測到新生神經(jīng)元的增加，這說明腦損傷誘發(fā)的腦神經(jīng)再生的分子機制還不為人所知。

對鼠類的幼年期和成年期的神經(jīng)發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)出生后幼鼠腦組織內(nèi)仍然存在有大量的新生神經(jīng)元，說明哺乳動物出生后早期腦內(nèi)仍然存在有神經(jīng)生發(fā)區(qū)，不斷產(chǎn)生的新生神經(jīng)元隨神經(jīng)遷移流不斷遷移，最終定位于腦組織不同部位完成神經(jīng)發(fā)育。成年后鼠腦內(nèi)的特定部位依然存在有神經(jīng)生發(fā)區(qū)，雖然與幼鼠相比該功能有所下調(diào)，但受到外界刺激或腦損傷后，該功能將會被再次激活上調(diào)，不斷生成新的神經(jīng)元。周艷玲等人[11]通過對大鼠實施慢性復(fù)合應(yīng)激后發(fā)現(xiàn)實驗動物的海馬齒狀回新生神經(jīng)元增多，動物的學(xué)習(xí)記憶能力明顯增強，說明外界刺激可上調(diào)海馬的神經(jīng)功能。Aevidsson A等人[12]通過對腦損傷的研究認為：腦損傷可誘發(fā)腦內(nèi)神經(jīng)生發(fā)區(qū)神經(jīng)前體細胞增加，但新生神經(jīng)元通過定向遷移至腦損傷區(qū)，與周圍神經(jīng)元形成突觸并完成構(gòu)建完整的神經(jīng)元回路，是實現(xiàn)神經(jīng)功能修復(fù)的重要過程，但研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)的新生神經(jīng)元未能完成上述過程而陸續(xù)死亡，僅僅有0.2%新生神經(jīng)元存活，并替代受損區(qū)神經(jīng)元發(fā)揮正常功能，了解掌握其中的神經(jīng)再生機制并進行人為干預(yù)，對于治療腦損傷具有非常重要的意義。

Doublecortin（DCX）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種在神經(jīng)發(fā)育中起調(diào)節(jié)作用特異性微管相關(guān)蛋白，參與了神經(jīng)元骨架的構(gòu)成，該蛋白位于神經(jīng)前體細胞中，同時在處于遷移狀態(tài)的未成熟神經(jīng)元中位于胞體和前導(dǎo)突起中，在新生神經(jīng)元前導(dǎo)突起中微管蛋白通過改變自身結(jié)構(gòu)，可使神經(jīng)元以伸展和回縮兩種交替形式發(fā)生遷移[13]，對于神經(jīng)元的定向移動遷移具有重要作用，保證了神經(jīng)元遷移的穩(wěn)定性。Doublecortin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中已被大量發(fā)現(xiàn)，實驗發(fā)現(xiàn)鼠腦中從胚齡11 d至出生后早期均有不同程度的DCX表達，胚胎腦組織中發(fā)現(xiàn)未成熟神經(jīng)元從開始遷移直至遷移完成的整個過程中都有DCX表達。所以DCX可作為新生神經(jīng)元的特異性標(biāo)記物，對于研究神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元的定向遷移有很重要的研究意義。