劉 限， 李 安， 高增貴， 姚 遠(yuǎn)

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，遼寧沈陽 110866； 2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧沈陽 110866)

近年來，除草劑大量和高劑量使用對環(huán)境和下茬作物的影響越來越受到人們的關(guān)注[1-3]。抑制光系統(tǒng)Ⅱ的除草劑莠去津在世界范圍內(nèi)被廣泛用來控制玉米和高粱田闊葉及1年生雜草，已經(jīng)應(yīng)用長達(dá)幾十年[4-8]。莠去津一般被認(rèn)為是不易礦化降解的化合物，其在土壤中的半衰期較長(1～12個月)。莠去津因其在土壤中流動性大，容易在地下水中檢測到，一般認(rèn)為莠去津是土壤或地下水的污染物[9-10]。莠去津雖然在控制農(nóng)田雜草中發(fā)揮了非常大的作用，但已有研究表明莠去津?qū)ν寥牢⑸?、水生生物甚至人類健康都有影響[11-14]。目前，土壤和水中有機(jī)污染物的清除一般可采用物理化學(xué)方法，比如換土、活性炭吸附、熱解析、土壤氧化、焚燒等方法，也可以采用具有降解有機(jī)污染物的微生物進(jìn)行生物修復(fù)[15]。土壤微生物在化學(xué)農(nóng)藥的降解和轉(zhuǎn)化中起著非常重要的作用，微生物可將持久性農(nóng)藥作為能源或營養(yǎng)來利用，也可通過和其他物質(zhì)共代謝來利用[16]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)諾卡氏菌屬(Nocardia)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)等19個屬的細(xì)菌具有降解土壤莠去津的能力[17-20]。這些菌株含有1種或幾種不同的降解基因(如atzA、atzB、atzC、atzD、atzE、atzF、atzC-trzD、trzN-atzB等)，能將莠去津完全或部分降解[21-25]，從而消除莠去津的毒性。但關(guān)于莠去津降解酶具體定位(胞內(nèi)或胞外)的研究還鮮有報道。因此，本研究利用筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的各種細(xì)菌，分離和篩選具有降解莠去津能力的細(xì)菌，并分析這些細(xì)菌在培養(yǎng)基和土壤中對莠去津的降解效果，驗(yàn)證獲得細(xì)菌的莠去津降解酶類的定位，以期為解決土壤中殘留莠去津的降解奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株：試驗(yàn)所用40株菌株來自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院免疫研究所保存的細(xì)菌(是土壤或植物內(nèi)生細(xì)菌)。

溶菌肉湯(lysogeny broth，簡稱LB)培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.4～7.6，于121 ℃滅菌30 min，備用。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.0～7.2，于121 ℃滅菌30 min，備用?；A(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基：KH2PO40.45 g，K2HPO41.79 g，Mg2SO40.10 g，NaCl 0.40 g，瓊脂18.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.5，于 121 ℃ 滅菌30 min，備用。Biolog通用生長(Biolog univcrsal growth，簡稱BUG)培養(yǎng)基：BUG瓊脂培養(yǎng)基57.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為 7.3±0.1，于121 ℃滅菌15 min，備用。

除草劑：莠去津原藥，有效成分大于97%，購自山東淄博新天地農(nóng)業(yè)機(jī)械有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 莠去津降解菌株的篩選及鑒定

1.2.1.1 含藥培養(yǎng)基配制 準(zhǔn)確稱取1 g莠去津原藥，加入10 mL無菌水，配制成莠去津母液，在99 ℃恒溫水浴鍋中水浴加熱，邊水浴邊不停攪拌，并滴入適量吐溫-80，至藥品粉末完全溶解。取900 μL莠去津母液加入到150 mL培養(yǎng)基中，搖勻，制成莠去津含量為600 μg/L的培養(yǎng)基。

1.2.1.2 耐藥性和可利用莠去津菌株的篩選 用LB培養(yǎng)基將待篩菌株活化培養(yǎng)2代，挑取活化后的菌株用無菌水稀釋菌液，使其D600 nm=1。將LB培養(yǎng)基制成平板，取200 μL菌液均勻地涂在平板上。以不含除草劑的LB培養(yǎng)基平板為對照，于30 ℃培養(yǎng)2 d后觀察細(xì)菌的菌落生長情況。每組3次重復(fù)。在LB培養(yǎng)基初篩基礎(chǔ)上，在只含有莠去津?yàn)樘荚吹幕A(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基上進(jìn)行進(jìn)一步篩選，取200 μL菌液(D600 nm=1)均勻地涂在以莠去津?yàn)樘荚吹幕A(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2 d后調(diào)查細(xì)菌菌落數(shù)。以常規(guī)的基礎(chǔ)無機(jī)鹽培養(yǎng)基(不含莠去津)為空白對照。每組3次重復(fù)。

1.2.1.3 細(xì)菌菌種鑒定 將篩選獲得的能利用莠去津?yàn)槲ㄒ惶荚吹木赀M(jìn)行革蘭氏染色，鑒定該細(xì)菌是陰性菌還是陽性菌。將菌株用BUG培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，用棉簽蘸取微量純培養(yǎng)菌，接入細(xì)菌鑒定用革蘭氏陰性/陽性接種液(GN/GP-IF)中，混勻。用濁度計(jì)測渾濁度，當(dāng)透光率達(dá)到98%時為最適。將接菌后的接種液倒入加樣槽，用八排道移液器快速接入Gen Ⅲ鑒定板中，于30 ℃恒溫培養(yǎng)16～24 h后，進(jìn)行微平板讀數(shù)，分析鑒定結(jié)果。

1.2.2 菌株N1和N34對莠去津降解效果

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)室液體培養(yǎng)條件下的降解效果 取20 mL菌液(D600 nm=1)接入150 mL含藥(600 μg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、120 r/min的搖床上連續(xù)培養(yǎng)7 d，分別于12、24、48、72、96、120、144 h取樣。設(shè)3次平行試驗(yàn)。

取5 mL培養(yǎng)液于25 mL具塞試管中，加入等體積的乙酸乙酯，在翻轉(zhuǎn)搖勻儀上充分振蕩提取10 min，靜置分層，取乙酸乙酯上層，收集的乙酸乙酯用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于42 ℃濃縮近干，用色譜級甲醇定容至1 mL，過0.2 μm有機(jī)濾膜。

將分離純化的提取液于島津高效液相色譜儀中進(jìn)行測定，莠去津液相色譜分析條件：色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，柱溫為30 ℃，波長為222 nm，流動相為甲醇 ∶水=70 ∶30(體積比)；流速為 0.8 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL。然后根據(jù)下面的公式計(jì)算土壤樣本中莠去津的含量：

式中：R為樣本中莠去津殘留濃度，mg/L；S樣為樣本峰面積，mV·min；C標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mg/L；V樣為樣本定容體積，mL；S標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積，mV·min；W為采樣量，L。

莠去津降解率的計(jì)算公式：

莠去津降解率=1-實(shí)測莠去津含量/莠去津添加量×100%；

莠去津絕對降解率=(Vt-VCK)/(1-VCK)×100%。

式中：Vt為接菌處理培養(yǎng)基中莠去津的降解率；VCK為未接菌處理培養(yǎng)基中莠去津的降解率。

1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)室土壤中的降解效果 取沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)連續(xù)3年沒有施過除草劑的表層10 cm土壤，在室內(nèi)通風(fēng)處自然風(fēng)干后，過100目篩。將土壤分裝成100 g/瓶，并保持土壤濕度在60%左右。分裝后的土壤分為2組，一組瓶裝土壤于121 ℃、30 min滅菌2次，另一組不滅菌。分別設(shè)不添加除草劑的對照處理和莠去津處理(終濃度為2 000 μg/kg)。將純化后的菌株用LB培養(yǎng)基活化2代，并稀釋為菌懸液，使其D600 nm=1，每瓶土壤接入20 mL菌懸液，每個處理3次重復(fù)。于室溫條件下培養(yǎng)，分別在1、3、5、7、14、21、28、35、42、49 d取樣，用于莠去津殘留量檢測。

超聲提?。簻?zhǔn)確稱取10 g土壤樣品于50 mL具塞離心管中，加入20 mL提取液混勻后，用超聲波清洗器超聲提取 30 min，再振蕩提取30 min后，加入5 g氯化鈉，于 5 000 r/min 離心5 min，取10 mL上清液于50 mL離心管中，在50 ℃水浴鍋中減壓旋轉(zhuǎn)蒸干，加入2 mL甲醇溶解，待凈化。

凈化：將5 mL甲醇移入石墨炭GCB小柱(小柱活化)后，移入2 mL樣品，再移入10 mL甲醇收集，50 ℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸干后，加入1 mL甲醇定容，過0.22 μm有機(jī)相針式濾器于進(jìn)樣小瓶中待測。液相檢測和降解率計(jì)算方法同“1.2.2.1”節(jié)。

1.2.3 細(xì)菌菌株N34中莠去津降解酶的定位

1.2.3.1 胞內(nèi)(外)粗酶液提取 將菌株N34接種于含有 1 000 mg/L 莠去津的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，于 180 r/min、30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h，取培養(yǎng)液于5 000 r/min離心15 min，取上清液并收集菌體。向上清液中加入硫酸銨，邊加入邊不停攪拌至硫酸銨飽和度達(dá)100%，鹽析過夜。于 4 ℃、10 000 r/min離心30 min，收集沉淀，將沉淀溶于pH值為7.0的0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中透析至無硫酸根，得到胞外粗酶液。細(xì)菌菌體用20 mL pH值為7.0的0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗滌2～3次。取菌體，加入3倍體積的緩沖液將菌體懸于緩沖液中。將菌懸液置于冰浴中用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎處理，超聲波破碎5 s，停5 s，共25個循環(huán)。于4 ℃、10 000 r/min離心30 min，取上清液，得到胞內(nèi)粗酶液。

1.2.3.2 胞內(nèi)(外)降解酶對莠去津降解效果的測定 為了確定莠去津降解酶是屬于胞內(nèi)酶還是胞外酶，取2.8 mL含 50 μg/L 莠去津、pH值為7.0的0.05 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，在30 ℃預(yù)熱，再加入200 μL預(yù)熱的胞內(nèi)(外)粗酶液，使酶反應(yīng)體系的總體積為3.0 mL；30 ℃水浴保溫2 h，加入0.2 mL 1 mol/L鹽酸中止酶反應(yīng)。每個處理3次重復(fù)，同時設(shè)不加酶液的處理為空白對照。然后用9 mL甲醇分3次萃取反應(yīng)液中剩余的莠去津，最后定容到10 mL，于 50 ℃ 水浴中旋轉(zhuǎn)蒸干，取1 mL甲醇定容，過0.22 μm濾膜，用液相色譜測定莠去津的含量，并計(jì)算降解率。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析方法 將所得數(shù)據(jù)通過Excel和SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 莠去津降解菌株的篩選及鑒定

將細(xì)菌稀釋液涂布到含有莠去津的LB培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)菌株N1和N34可以在含莠去津的培養(yǎng)基上生長(圖1)，而其他38株細(xì)菌均不能在含莠去津的培養(yǎng)基上生長。進(jìn)一步在含有莠去津而未加其他碳水化合物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在以莠去津?yàn)樘荚吹那闆r下，這2株細(xì)菌都可以正常生長，細(xì)菌菌株N1和N34的菌落數(shù)分別為254、462個(圖2)，由此可以看出這2株細(xì)菌都能降解或利用莠去津。

經(jīng)革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)，菌株N1和N34均呈陽性反應(yīng)，均為革蘭氏陽性菌。利用Biolog微生物自動鑒定儀對2株菌株進(jìn)行菌種鑒定，結(jié)果如表1所示，鑒定得出菌株N1為腐葉芽孢桿菌(Bacillusdecisifrondis)，菌株N34為弗雷尼棒狀桿菌(Corynebacteriumfreneyi)。

表1 用Biolog微生物鑒定儀對2株菌株的鑒定結(jié)果

2.2 菌株N1和N34對莠去津的降解效果

在農(nóng)藥殘留分析中，常用添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)差來衡量準(zhǔn)確度和精密度。本試驗(yàn)分別分析了莠去津在無機(jī)鹽培養(yǎng)基和土壤中的回收率。按照建立的樣本提取方法和色譜條件對樣本進(jìn)行測定，并用相近濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液單點(diǎn)校正。由表2可知，莠去津在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的平均回收率為83.54%～95.31%，相對標(biāo)準(zhǔn)差為1.23%～5.98%；莠去津在土壤中的平均回收率為90.23%～113.29%，相對標(biāo)準(zhǔn)差為3.32%～4.81%，符合農(nóng)藥殘留分析要求。

表2 莠去津在無機(jī)鹽培養(yǎng)基和土壤中的添加回收率

由表3可知，在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中莠去津自然降解率在144 h只有27.58%，加入莠去津降解菌后，降解率明顯提高。菌株N1對莠去津的降解率在12～72 h持續(xù)上升，在72 h時絕對降解率達(dá)55.34%，之后上升幅度變小，在96 h后絕對降解率維持在62%左右。菌株N34對莠去津的降解率在48～96 h上升幅度較大，在96 h時絕對降解率達(dá)90.39%，之后降解率變化幅度較小，由此可以看出菌株N34對莠去津的降解作用明顯優(yōu)于菌株N1。

在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中菌株N34對莠去津的降解效果明顯好于菌株N1，因此檢測菌株N34在土壤中對莠去津的降解作用。由表4、表5可知，無論在滅菌土壤還是未滅菌土壤中，除草劑莠去津的自然降解速度均較快，但加入菌株N34后降解速度更快。在滅菌土壤中菌株N34對莠去津的降解率在28 d時就達(dá)到了90%左右，絕對降解率在49 d時為 62.33%；在未滅菌土壤中，在21 d時菌株N34對莠去津的降解率就達(dá)到了90%以上，絕對降解率最高，為62.80%。由此可以看出菌株N34對除草劑莠去津具有明顯的降解作用，可以用作田間土壤中莠去津的清除。同時研究發(fā)現(xiàn)，未滅菌土壤中莠去津的自然降解率基本均高于滅菌土壤中莠去津的自然降解率，說明土壤中存在的微生物對莠去津也有降解作用。

表3 菌株N1和N34在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中對莠去津的降解率

表4 菌株N34在滅菌土壤中對莠去津的降解率

表5 菌株N34在未滅菌土壤中對莠去津的降解率

2.3 莠去津降解酶定位

由表6可知，胞外粗酶液對莠去津的降解率與對照相似，說明細(xì)菌N34菌株不分泌莠去津降解酶于培養(yǎng)液中；而胞內(nèi)粗酶液對莠去津有明顯的降解活性，降解率達(dá)到99.00%。由此可見，菌株N34產(chǎn)生的降解酶主要位于細(xì)胞內(nèi)，說明細(xì)菌N34應(yīng)該是通過生長利用代謝來降解莠去津的。

表6 菌株N34胞內(nèi)(外)降解酶對莠去津的降解作用

3 結(jié)論與討論

微生物對除草劑的反應(yīng)是多種多樣的，現(xiàn)有研究表明，除草劑對土壤微生物有刺激生長和抑制生長的作用[26-28]，說明不同微生物對除草劑具有不同的響應(yīng)機(jī)制。本研究也發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)菌菌株對莠去津的響應(yīng)不同，有的菌株對莠去津非常敏感，在含莠去津的培養(yǎng)基上不能生長，有的菌株能夠生長，但不能利用莠去津，達(dá)不到降解莠去津的效果。本研究從40株細(xì)菌中篩選出2株莠去津降解菌，分別為菌株N1和N34，而且2株菌株的降解能力也有一定差距，因此除草劑降解菌的篩選最好能夠在含有除草劑為唯一氮源或碳源的培養(yǎng)基上進(jìn)行，提高獲得降解菌的效率。另外，微生物降解除草劑主要通過2種機(jī)制來進(jìn)行，一是通過生長代謝，微生物直接利用除草劑為氮源或碳源來降解；另一種是通過共代謝作用，微生物需要其他碳氮源來生長，通過改變難降解除草劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)來分解，而且往往須要誘導(dǎo)作用才能發(fā)揮作用[29-31]。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株N34并不是通過分泌降解酶來降解莠去津，而是通過生長代謝來達(dá)到目的。

滅菌土壤中莠去津的降解效果不如未滅菌土壤，這可能與土壤中的微生物有關(guān)[32]。很多研究表明，微生物在莠去津殘留土壤修復(fù)中起著重要的作用[33]，本研究中篩選得到的菌株N34在培養(yǎng)基和土壤中對莠去津的絕對降解率都達(dá)到了60%以上，說明該菌株可以用來修復(fù)莠去津殘留土壤。另外，微生物修復(fù)除草劑污染土壤過程中還受到土壤中有機(jī)質(zhì)和其他營養(yǎng)成分的影響[34]，因此提高菌株N34對莠去津的降解效果還須要進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)研究，以提高菌株N34對莠去津的降解作用。