錢 瑋， 陳宏偉， 胡翠英， 邱業(yè)先

(蘇州科技大學(xué)，江蘇蘇州 215009)

土壤微生物是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中重要組成部分，主要包括細(xì)菌、真菌和古菌等，它們影響許多重要的生態(tài)過程，如植物對養(yǎng)分的獲取，氮、碳、磷等物質(zhì)的生物地球化學(xué)循環(huán)，并且對周圍的土壤壞境十分敏感[1-2]。土壤微生物數(shù)量、群落組成及分布等指標(biāo)已被公認(rèn)為土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預(yù)警及敏感指標(biāo)，目前土壤微生物多樣性及功能的研究已引起國內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注[3]。

相關(guān)學(xué)者前期通過T-RFLP、PLFA、DGGE等手段分析了土壤細(xì)菌的多樣性，并探討施肥方式對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響[4-7]。但上述研究方法靈敏度有限，只能分析豐度大于1%的優(yōu)勢類群，而高通量測序技術(shù)可分析豐度大于1‰的類群，能較全面地反映微生物的群落結(jié)構(gòu)，成為微生態(tài)學(xué)研究的主要方法[8]。

筆者運(yùn)用高通量測序技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法，分析了蘇州地區(qū)果園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)以及微生物與土壤環(huán)境因子之間的關(guān)聯(lián)，為研究不同土地利用方式對土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響積累了有價值的試驗資料，可為土壤生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)和健康狀況評估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 樣品采集 取樣地點(diǎn)位于江蘇省蘇州市金庭鎮(zhèn)某農(nóng)場(31°11.4′～31°11.6′ N，120°29.8′～120°30.2′ E)，金庭鎮(zhèn)位于中國第二大淡水湖——太湖之中，是我國淡水湖泊中最大的島嶼，該地屬北亞熱帶濕潤性季風(fēng)氣候類型，年平均溫度約16 ℃，降水量在1 000～15 000 mm，加上太湖水體調(diào)節(jié)作用，成為國家級現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園區(qū)。農(nóng)場內(nèi)主要種植茶樹、枇杷、柑橘、蔬菜等經(jīng)濟(jì)作物，于2015年11月在農(nóng)場的茶樹林、枇杷林、柑橘林、青菜地、野草地內(nèi)分別設(shè)置10 m×10 m樣方，在樣方內(nèi)5點(diǎn)取樣，每份樣品設(shè)置3個重復(fù)。采集0～10 cm的土壤，去除植物殘體和石塊，混合均勻后分成2份，置于無菌袋中帶回實驗室-20 ℃保存，1份用于測定理化指標(biāo)，1份用于微生物多樣性研究[9]。

1.1.2 試劑 PowerSoil DNA提取試劑盒，美國MoBio；PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR引物等均購自上海生工生物工程有限公司。

1.1.3 儀器 高速冷凍離心機(jī)，GL-20G-Ⅱ，上海安亭生產(chǎn)；小型臺式高速離心機(jī)，5417R，德國艾本德生產(chǎn)；凝膠成像分析儀，Universal Hood Ⅱ，美國伯樂生產(chǎn)；PCR擴(kuò)增儀，5332，德國艾本德生產(chǎn)；恒溫水浴鍋，HH·S21-4-S，上海精宏生產(chǎn)；高壓蒸汽滅菌鍋，YXQ-LS-50SII，上海博訊生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 土壤樣品的理化分析 土壤含水率采用烘干恒重法測定；pH值采用電極法測定；有機(jī)質(zhì)采用灼燒法測定；速效鉀采用醋酸銨浸提-原子吸收光度法測定；速效磷采用鹽酸-硫酸浸提-鉬藍(lán)比色法測定；速效氮采用堿解蒸餾法測定；氨氮采用氯化鉀浸提-納氏試劑比色法測定[10]。

1.2.2 土壤總DNA提取、擴(kuò)增和高通量測序 使用PowerSoil DNA提取試劑盒，按照操作手冊提取土壤中總DNA，采用引物515F(5′- GTGYCAGCMGCCGCGGTA-3′ )和909R(5′- CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3′ )擴(kuò)增原核生物16S rDNA V4-V5區(qū)[11-12]。25 μL PCR反應(yīng)體系中包含0.25 μL ETaq酶 (5 U/μL)，2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)，1 μL模板DNA(20 ng/μL)，1 μL 引物F(10 μmol/L)，1 μL引物R(10 μmol/L)，17.5 μL無菌蒸餾水。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共27個循環(huán)；然后72 ℃ 延伸5 min。3份重復(fù)的PCR產(chǎn)物混勻純化后構(gòu)建DNA文庫，然后由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina公司Miseq 2×250 bp平臺進(jìn)行測序。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析 高通量測序結(jié)果通過QIIME(Quantitative Insights Into Microbial Ecology) pipeline[13]進(jìn)行分析。原始數(shù)據(jù)使用FastQC(http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)進(jìn)行質(zhì)檢，去除低質(zhì)量片段后的成對雙末端序列根據(jù)重疊區(qū)融合成一條序列，根據(jù)barcode標(biāo)簽判斷序列來源并區(qū)分樣品。然后利用Usearch算法[14]在97%相似度水平[15]下進(jìn)行OUT(operational taxonomic unit)聚類，每個OUT的代表序列依據(jù)silva數(shù)據(jù)庫采用RDP classifier[16]按照界、門、綱、目、科、屬、種分配分類單元。然后用QIIME軟件計算各樣品的α-多樣性和β-多樣性。典范對應(yīng)分析(CCA)運(yùn)用R軟件Vegan程序包完成[17]。

本研究其他的數(shù)據(jù)分析使用SPSS 15.0完成，圖形制作使用R 3.1.2軟件(R-Development Core Team，2014)完成。

1.2.4 登陸號 本研究所涉及土壤樣本16S rDNA序列已經(jīng)提交至NCBI SRA數(shù)據(jù)庫，登陸號分別為SUB1054781、SUB1054794、SUB1054825、SUB1054826、SUB1054827。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

土壤樣品的理化性質(zhì)檢測結(jié)果見表1，枇杷樹、橘樹土壤中有機(jī)質(zhì)含量顯著高于其他樣本，枇杷樹土壤中速效磷、速效鉀顯著高于其他土壤，分別為271.5、96.4 mg/kg，而茶樹土壤中速效鉀、速效氮分別為31.7、12.3 mg/kg，顯著低于其他樣本。橘樹、茶樹、枇杷樹這3種木本植物根際土壤呈酸性，生長草本植物的土壤呈弱堿性。

表1 不同土壤樣品理化性質(zhì)比較

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。A、B、C、D、E分別表示橘樹土、茶樹土、枇杷樹土、青菜土、草地土，表2、圖1、圖2、圖3同。

2.2 土壤原核微生物群落多樣性分析

對5個樣品進(jìn)行高通量測序，共得到2.16 GB原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過質(zhì)控、拼接和過濾處理后共獲得179 831條有效的16S rDNA序列，序列長度分布在390～426 bp，平均長度為 396 bp，與擴(kuò)增目的片段長度吻合。從圖1可以看出，隨著測序讀條數(shù)的增加，曲線趨近于平坦，說明樣本中大部分物種信息(OUT)已經(jīng)得到，能夠滿足后續(xù)分析的需要，而繼續(xù)增加測序數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量新的物種。為消除各樣本間序列總數(shù)差異對后續(xù)分析的影響，把各樣本序列數(shù)抽平到15 000條。然后在97%序列相似性水平下劃分OUT，刪除豐度小于總序列數(shù)0.01%的OUT，共獲得960個OTU。5個土壤樣品中平均含有570個OUT，其中青菜地土壤中原核微生物種類最多，為705個OUT；而茶樹林土壤中微生物種類最少，為385個OUT。

不同樣品中原核微生物群落的α-多樣性分析結(jié)果見表2，由Chao指數(shù)和Ace指數(shù)可見枇杷樹和青菜土壤樣品中微生物種類最多，茶樹和草地土壤中微生物種類較少。就Shannon指數(shù)而言，枇杷樹土壤中微生物多樣性最高，為 6.53；而茶樹土壤中微生物多樣性最低，為4.61；橘樹、青菜和草地土壤的微生物多樣性介于二者之間。

表2 不同土壤樣品中原核微生物群落α-多樣性指數(shù)

2.3 土壤原核微生物群落組成

從圖2-A可以看出，蘇州果園土壤中豐度較高的門為變形菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、放線菌門、綠彎菌門，平均豐度分別為42.6%、22.0%、9.3%、7.2%、4.6%。其中枇杷樹、青菜土壤中擬桿菌含量為16.9%，明顯高于其他樣品的 4.1%，但它們的酸桿菌含量為15.7%，低于其他土壤的 26.1%。草地土壤中屬于古菌域的泉古菌門豐度為16.9%，遠(yuǎn)高于另外4個樣品的1.5%。

從圖2-B可以看出，土壤中豐度較高的科為黃色單胞菌科、酸桿菌科、Chitinophagaceae、紅螺菌科、華桿菌科，平均豐度分別為10.4%、9.8%、9.3%、6.8%、6.6%。屬于泉古菌門的SAGMA-X科微生物在草地樣本中豐度為24.87，明顯高于橘樹和茶樹樣本的3.7%，而枇杷樹、青菜土壤中SAGMA-X科屬于低豐度微生物，平均豐度為0.03%。

選取平均豐度前100的OUT，根據(jù)分類信息和各OUT在不同樣本中的分布，繪制土壤中原核微生物系統(tǒng)發(fā)生學(xué)分布圖(圖3)。從綱水平來看，土壤微生物主要分布于酸桿菌綱、擬桿菌綱、γ-變形菌綱和β-變形菌綱。從不同樣本群落組成來看，枇杷樹和青菜土壤中Cytophagaceae、黃桿菌屬、厭氧繩菌綱和β-變形菌綱的豐度高于其他樣本，但纖線桿菌綱、酸桿菌科、α-變形菌綱、γ-變形菌綱和泉古菌門微生物含量低于其他樣本。

2.4 環(huán)境因子對群落結(jié)構(gòu)的影響

為進(jìn)一步分析環(huán)境因子對土壤微生物群落的影響，本研究在OUT水平進(jìn)行了群落結(jié)構(gòu)與土壤理化指標(biāo)的典范對應(yīng)分析(CCA)。從圖4可以看出，第一軸對樣本間物種差異解釋度為66.1%，第二軸解釋度為18.6%，總體解釋度超過80%。，根據(jù)環(huán)境因子的軸長，可以判斷pH值和速效氮含量對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響大于其他因子。速效氮與OTU5、6、9有較強(qiáng)的正相關(guān)性，與其他OUT呈負(fù)相關(guān)，而OTU5、6、9也是樣本C、D的代表微生物類群。pH值與OTU2有較強(qiáng)的正相關(guān)，而與OTU8、1呈負(fù)相關(guān)，即酸性環(huán)境有助于提高OTU8和1在群落中的豐度，最終形成樣本A、B類似的群落結(jié)構(gòu)。這些主要OUT的代表序列提交至NCBI，BLAST比對結(jié)果見表3，表明多數(shù)OTU 代表序列與 GenBank收錄序列相似度低于97%，可能為一些分類地位尚不明確的微生物，還需要進(jìn)一步研究[18]。

表3 主要OUT代表序列BLAST比對結(jié)果

3 討論與結(jié)論

以宏基因組學(xué)方法探究了蘇州果園不同土地利用方式對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，發(fā)現(xiàn)種植橘樹和茶樹的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)相似，種植枇杷樹和青菜區(qū)域的群落組成基本一致，但是這些植物的生長都引起了土壤微生物群落的較大變化(相比草地而言)。最主要表現(xiàn)在于草地土壤中豐度較高的泉古菌門微生物在種植土壤中豐度大大降低，由16.9%降至1.5%，但是該類群微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的作用以及其豐度降低對生態(tài)系統(tǒng)的影響還需要進(jìn)一步研究[18]。結(jié)合環(huán)境因子與群落結(jié)構(gòu)的典范對應(yīng)分析表明，土壤pH值和速效氮的含量是影響原核微生物群落組成的主要因子，但是這些環(huán)境因子的變化是種植方式(施肥或者松土等)不同引起的，還是由于植物和共生微生物協(xié)同作用引起的，目前仍是土壤微生物生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)問題[19-20]。