陳曉蘭， 楊海峰， 張 龍

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

豬藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的豬繁殖與呼吸障礙性疾病，又稱豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，簡稱PRRS)，該病以繁殖障礙、呼吸困難、耳朵藍(lán)紫色為主要癥狀，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，在發(fā)病過程中還會(huì)并發(fā)其他傳染病[1]。該病的發(fā)生沒有明顯的季節(jié)性，通常經(jīng)呼吸道傳播，患病豬和帶毒豬均可以向空氣中排毒，嚴(yán)重污染周圍的環(huán)境，若消毒措施做得不到位，病毒能在豬場內(nèi)長期存在。氣候驟變或未經(jīng)檢測直接引進(jìn)豬種，是本病誘因[2]。

目前該病沒有特殊的治療方法，預(yù)防被認(rèn)為是最為有效的手段。而藍(lán)耳疫苗在免疫過程中，經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)免疫失敗，疫苗免疫效果差是其中最為重要的原因。因此，本研究在藥理試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇桑杜口服液(MP-EUP oral solution)作為免疫增強(qiáng)劑，觀察其對豬藍(lán)耳疫苗免疫效果的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物和疫苗

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome viru，簡稱PRRSV)活疫苗(R98株，批號為1201030)，購于江蘇南農(nóng)高科技股份有限公司，根據(jù)使用說明在臨用前用40 mL滅菌生理鹽水進(jìn)行稀釋。

復(fù)方桑杜口服液，是由桑葉多糖和杜仲水提物制成的口服液，總多糖含量為24 mg/mL，由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院提供。取適量體積桑杜口服液，將其稀釋為2.4、1.6、0.8 mg/mL，待用。

1.2 試劑與儀器

PRRSV ELISA抗體檢測試劑盒，購自武漢科前生物股份有限公司；Porcine IgG ELISA KIT、Porcine IL-2 ELISA KIT、Porcine IFN-γ ELISA KIT均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；高速冷凍離心機(jī)，購自上海安亭科學(xué)儀器廠；酶標(biāo)儀-ELX800，購自美國伯騰儀器有限公司。

1.3 動(dòng)物及免疫

100頭30日齡健康三元雜交仔豬(海安某養(yǎng)殖場)，飼喂豬全價(jià)飼料。隨機(jī)分為5組，每組20頭。分組與處理方法見表1。33日齡時(shí)各免疫組頸部肌注射稀釋好的PRRSV活疫苗(R98株)，1 mL/頭，各給藥組分別于免疫前3 d開始給藥，桑杜口服液高、中、低劑量組分別灌胃總多糖濃度為2.4、1.6、0.8 mg/mL的桑杜口服液稀釋溶液各5 mL。連續(xù)給藥 7 d，首免后30 d(即63日齡時(shí))進(jìn)行二免(二免方法同首免)，二免前3 d對3個(gè)給藥組同法給藥。

注：MP-EUPH表示桑杜口服液高劑量；MP-EUPM表示桑杜口服液中劑量；MP-EUPL表示桑杜口服液低劑量。下表同。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 臨床體征觀察 每天觀察記錄各組豬的精神狀態(tài)、采食、飲水、糞便等變化情況。

1.4.2 血清抗體及相關(guān)細(xì)胞因子含量 豬首次免疫后7、14、21、28 d，每組隨機(jī)抽取4頭豬，進(jìn)行前腔靜脈采血，5 mL/頭，制備血清。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，簡稱ELISA)測定血清中豬藍(lán)耳特異性抗體效價(jià)，并測定免疫后7、14、21 d各組血清中白介素2(IL-2)、γ-干擾素(IFN-γ)、免疫球蛋白G(IgG)等細(xì)胞因子的分泌量。

1.4.3 體質(zhì)量 分別于30日齡和60日齡稱取各組豬體質(zhì)量，并計(jì)算平均增質(zhì)量率：增質(zhì)量率=[(稱量體質(zhì)量-首免前體質(zhì)量)/首免前體質(zhì)量]×100%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 18.0軟件進(jìn)行Duncan’s多重分析，比較血清抗體、相關(guān)細(xì)胞因子及體質(zhì)量變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床體征變化

試驗(yàn)期間，各組豬精神狀態(tài)良好，采食、飲水正常，糞便正常，未見死亡。

2.2 血清抗體效價(jià)的變化

由表2可知，在首免前，各組血清特異性抗體效價(jià)無顯著差異；在首免后7 d，各給藥組的血清抗體效價(jià)均顯著高于免疫對照組和空白對照組；在首免后14 d，中劑量組抗體效價(jià)顯著高于其他各組；在首免后21、28 d，高、中劑量組均顯著高于免疫對照組和空白對照組。

表2 中藥復(fù)方多糖對免疫豬藍(lán)耳疫苗豬血清抗體效價(jià)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下表同。

2.3 血清IL-2濃度的變化

由表3可知，豬首次免疫豬藍(lán)耳疫苗后7 d，桑杜口服液中劑量組血清中的IL-2濃度顯著高于除高劑量組外的其他各組；在首免后14 d，中劑量組血清中IL-2濃度顯著高于其他各組；在首免后21 d，高、中劑量組血清中IL-2濃度顯著高于其他各組。

表3 血清中IL-2濃度的變化

2.4 血清IFN-γ濃度的變化

由表4可知，豬首次免疫豬藍(lán)耳疫苗后7、14 d，復(fù)方桑杜口服液高、中劑量組血清IFN-γ濃度顯著高于其他各組；在首免后21 d，中劑量組血清IFN-γ濃度顯著高于除高劑量組外的其他各組。

表4 血清中IFN-γ濃度的變化

2.5 血清IgG濃度的變化

由表5可知，豬首次免疫豬藍(lán)耳疫苗后7 d，各免疫組血清IgG濃度顯著高于空白對照組；在首免后14 d，桑杜口服液所有給藥組血清IgG濃度顯著高于免疫對照組和空白對照組；在首免后21 d，桑杜口服液組中劑量組血清IgG濃度顯著高于免疫對照組和空白對照組。

表5 血清中IgG濃度的變化

2.6 各組豬體質(zhì)量的變化

由表6可知，各組仔豬30日齡時(shí)體質(zhì)量相似，無顯著差異；60日齡時(shí)復(fù)方桑杜口服液中劑量組體質(zhì)量和增質(zhì)量率最大，增質(zhì)量率顯著高于其他各組。

表6 各組體質(zhì)量的變化

3 結(jié)論與討論

機(jī)體免疫力低下常常誘發(fā)動(dòng)物疾病的發(fā)生[3]。中藥多糖有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫[4]、降低血糖、抗癌[5]、抗衰老、抗輻射等多種作用[6]。因綠色、環(huán)保、低毒、低殘留等特點(diǎn)[7]，其增強(qiáng)免疫活性倍受重視[8]。因此，在藥理研究基礎(chǔ)上，開展桑杜口服液增強(qiáng)免疫的臨床效果研究。

PRRSV免疫豬后，在血清中會(huì)產(chǎn)生特異性PRRSV抗體，抗體效價(jià)越高，則產(chǎn)生的免疫保護(hù)力越強(qiáng)[9]。因此，本試驗(yàn)選擇豬藍(lán)耳病血清特異性抗體作為疫苗免疫水平的指標(biāo)。結(jié)果表明，在免疫后的所有時(shí)間點(diǎn)桑杜口服液中劑量組豬藍(lán)耳病血清特異性抗體效價(jià)顯著高于低劑量組、免疫對照和空白對照組，與高劑量組效價(jià)相似。表明豬在免疫前3 d口服桑杜口服液，連續(xù)給藥7 d，能顯著提高特異性抗體產(chǎn)生水平，增強(qiáng)體液免疫功能。

T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其釋放的多種細(xì)胞因子也參與細(xì)胞免疫、體液免疫、炎癥反應(yīng)、損傷修復(fù)等多項(xiàng)重要生理過程[10]。IL-2主要由Th1細(xì)胞分泌，為T細(xì)胞生長因子，是造成T細(xì)胞增殖的主要細(xì)胞因子，除刺激T細(xì)胞外，還能刺激NK細(xì)胞的生長，并增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力，同時(shí)激發(fā)B細(xì)胞生長，促進(jìn)抗體的產(chǎn)生[10]。IFN-γ是由Th1細(xì)胞分泌的，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫[11]，如可激活單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)及增加MHCⅠ類分子和MHCⅡ類分子的表達(dá)，促進(jìn)T細(xì)胞的分化，增強(qiáng)抗原呈遞，從而促進(jìn)機(jī)體特異性免疫[10，12]。因此，血清中IL-2和IFN-γ的濃度的大小可反映機(jī)體細(xì)胞免疫功能[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，桑杜口服液高、中劑量組在首免后大部分時(shí)間點(diǎn)血清中IL-2和IFN-γ含量均顯著高于低劑量組、免疫對照組和空白對照組。說明桑杜口服液在高、中劑量時(shí)能顯著提高豬體細(xì)胞免疫功能。

動(dòng)物在受到抗原刺激后可產(chǎn)生免疫球蛋白，其中IgG作為一種免疫球蛋白有抗菌、抗病毒、中和毒素、調(diào)理、凝集和沉淀抗原等作用，在體液免疫中非常重要[14]。本試驗(yàn)中桑杜口服液高、中劑量組在首免后14和21 d血清中IgG含量均顯著高于免疫對照組和空白對照組，表明桑杜口服液配合豬藍(lán)耳病疫苗一起使用可顯著提高血清IgG水平，增強(qiáng)機(jī)體的抗菌、抗病毒和抗毒素水平。

結(jié)果顯示，60日齡時(shí)復(fù)方桑杜口服液中劑量組體質(zhì)量和增質(zhì)量率最大，表明中劑量組不僅能提高疫苗的免疫水平，還具有顯著的增質(zhì)量效果?？梢缘贸鼋Y(jié)論：豬在接種豬藍(lán)耳病疫苗的同時(shí)以8 mg/頭劑量灌胃桑杜口服液，可顯著提高豬藍(lán)耳病特異性抗體產(chǎn)生水平，可增強(qiáng)IL-2、IFN-γ介導(dǎo)的細(xì)胞免疫功能和IgG介導(dǎo)的體液免疫功能。