朱艷霞， 黃燕芬， 柯 芳

(廣西壯族自治區(qū)藥用植物園/廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室，廣西南寧 530023)

滇重樓(Parispolyphyllavar.yunnanensis)的干燥根莖是我國傳統(tǒng)名貴中藥材重樓的基源之一，具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效[1]。近年來，由于人們掠奪式采挖，其野生資源瀕臨滅絕，已被列為國家二級瀕危藥用植物和云南省稀缺瀕危天然藥物[2-4]。滇重樓種子成熟時胚發(fā)育不完整[5]，外種皮和種子中存在種子萌發(fā)抑制物[6-8]，內(nèi)源脫落酸含量高[9]等是造成其種子休眠的主要原因，去除種皮[10]、變溫層積[11]、超聲波處理[12]、濕沙層積協(xié)同赤霉素處理[13]、低溫層積協(xié)同紅外光照射[14]等處理均能解除種子休眠狀態(tài)，發(fā)芽適宜的溫度是18～20 ℃，適宜的光照是750～1 500 lx的弱光，適宜的發(fā)芽床是沙[15-17]。隨著滇重樓種子萌發(fā)機制的深入研究，野生變家種技術(shù)也成功突破，目前云南、四川、貴州、廣西、湖南等地均有成功引種栽培滇重樓的報道。隨著滇重樓栽培區(qū)域的不斷擴大，引進地生態(tài)環(huán)境與原生地環(huán)境差異越來越大，但對滇重樓種子的研究主要集中于休眠機理和休眠解除方法，尚未見種子質(zhì)量的產(chǎn)地變異研究。本試驗收集20個滇重樓種植基地的成熟種子，測定種子形態(tài)和發(fā)芽率，進行聚類分析，揭示產(chǎn)地與種子質(zhì)量的關(guān)系，以期為滇重樓人工栽培過程中種子質(zhì)量評價、種源質(zhì)量的產(chǎn)地劃分和確定優(yōu)良種源的引種地提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試滇重樓種子2016年10月采自云南、貴州、廣西等地，將新鮮果實采收后用清水搓洗除去果皮和假種皮得凈種子，測定種長、種寬和千粒質(zhì)量。凈種子分成2份，1份直接做發(fā)芽試驗，1份低溫層積3個月后再測發(fā)芽率。低溫層積方法是將凈種子與濕珍珠巖按體積比為1 ∶3混合均勻，置于4 ℃恒溫恒濕條件下保存3個月。

1.2 方法

1.2.1 種長和種寬測定 隨機選取凈種子20粒，用電子游標(biāo)卡尺測定種子縱軸最長處的長度為種長，種子橫軸最短處的長度為種寬，取平均值。

1.2.2 千粒質(zhì)量測定 隨機選取凈種子1 000粒，用電子天平測定質(zhì)量，4次重復(fù)，取平均值。

1.2.3 發(fā)芽率測定 隨機選取種子100粒，清水沖洗干凈，再擺放至內(nèi)鋪3 cm厚濕潤珍珠巖的發(fā)芽盒內(nèi)，發(fā)芽盒置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，以15、20、25 ℃恒溫或15 ℃/25 ℃變溫，12 h光—12 h暗的交替光照條件培養(yǎng)，每隔15 d補水保持珍珠巖濕潤，置床后每隔30 d檢查種子發(fā)芽率，胚根突破種皮2 mm視為萌發(fā)，4次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

使用Microsoft Excel 2007對數(shù)據(jù)進行記錄整理，SPSS 18.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地滇重樓種子大小和質(zhì)量

從表1的結(jié)果可見，20份滇重樓種子的平均長度、寬度、千粒質(zhì)量分別為6.373 mm、4.271 mm、44.54 g。種長最小的是S3，最大的是S12，分別為5.964 mm和7.160 mm。種寬最小的是S14，最大的是S12，分別為4.036 mm和4.648 mm。千粒質(zhì)量最小的是S1，最大的是S5，分別為34.35 g和51.36 g。由表2的相關(guān)性分析結(jié)果可知，種長與千粒質(zhì)量顯著相關(guān)，種寬與千粒質(zhì)量極顯著相關(guān)。

表1 滇重樓種子大小和質(zhì)量

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母代表0.05水平差異顯著。下同。

表2 種子形態(tài)的相關(guān)性分析

注：“**”表示在0.01水平上(雙尾)相關(guān)性顯著，“*”表示在0.05水平上(雙尾)相關(guān)性顯著。

2.2 不同產(chǎn)地滇重樓新鮮種子的發(fā)芽率

新鮮種子直接點播于珍珠巖發(fā)芽床，25 ℃恒溫條件下測得的發(fā)芽率結(jié)果見表3。由表3可知，滇重樓新鮮種子培養(yǎng)5個月未見種子萌發(fā)；第6個月發(fā)芽率為2.2%，其中S1發(fā)芽率最高，為4.5%，與S3、S5、S6無顯著差異，但顯著高于其他16個采集地的種子(P<0.05)；第7個月發(fā)芽率提高至5.2%，其中S2發(fā)芽率最高，為7.5%，顯著高于S14、S18(P<0.05)，但與其他17個采集地的無顯著差異；第8個月發(fā)芽率增至11.4%，其中S10發(fā)芽率最高，為16.0%，S8發(fā)芽率最低，僅為9.5%，顯著低于S5、S10、S13號(P<0.05)，但與其他16個采集的種子無顯著差異。結(jié)果說明，未低溫層積處理的新鮮種子發(fā)芽率較低，發(fā)芽時間長，20份種子中除發(fā)芽率較低的S8和發(fā)芽率較高的S5、S10、S13外，其他多數(shù)種子的發(fā)芽率無顯著差異。

表3 滇重樓新鮮種子發(fā)芽率

2.3 不同產(chǎn)地滇重樓種子低溫層積后的發(fā)芽率

4 ℃恒溫恒濕條件下層積3個月的滇重樓種子，在25、20、15 ℃恒溫和15 ℃/25 ℃變溫條件下的發(fā)芽率結(jié)果見表4。

發(fā)芽培養(yǎng)溫度為25 ℃恒溫時：第2個月發(fā)芽率均值 3.9%，其中S2發(fā)芽率最高，S13最低；第3個月S2發(fā)芽率最高，為25.3%，顯著高于S1、S3、S4、S5(P<0.05)，與其他15個采集地?zé)o顯著差異；第4個月S9發(fā)芽率最高，為52.5%，顯著高于S2(P<0.05)，與其他18個采集地?zé)o顯著差異；第5個月發(fā)芽率最高和最低的分別是S20和S6，分別為 62.0% 和55.3%，20個采集地之間無顯著差異。

發(fā)芽培養(yǎng)溫度為20 ℃恒溫時：第2個月發(fā)芽率均值 4.4%；第3個月發(fā)芽率升至22.7%，20個采集地之間無顯著差異；第4個月S20發(fā)芽率最高，為54.0%，顯著高于S4、S7、S9、S11、S12、S13、S14、S19(P<0.05)，與其他11個采集地?zé)o顯著差異；第5個月S17發(fā)芽率最高，為65.8%，顯著高于S3、S4、S6(P<0.05)，與其他16個采集物無顯著差異，S3發(fā)芽率最低，為59.0%，顯著低于S17和S19(P<0.05)，與其他17個采集地之間無顯著差異。

發(fā)芽培養(yǎng)溫度為15 ℃恒溫時：第2個月發(fā)芽率均值僅為1.9%；第3個月S12發(fā)芽率最高，為15.0%，顯著高于S1、S3、S4、S5、S10、S11、S16(P<0.05)；第4個月發(fā)芽率均值升至 23.7%，20個采集地之間無顯著差；第5個月20個采集地之間無顯著差異。

表4 滇重樓層積種子發(fā)芽率 %

發(fā)芽培養(yǎng)溫度為15 ℃/25 ℃變溫時：第2個月發(fā)芽率為3.5%；第3個月發(fā)芽率迅速上升至31.9%，其中S2發(fā)芽率最高，為35.5%，顯著高于S5、S13、S14、S18(P<0.05)，與其他15個采集地?zé)o顯著差異；第4個月S12發(fā)芽率最高，為 68.8%，顯著高于S6號(P<0.05)，與其他18個采集地?zé)o顯著差異；第5個月S18發(fā)芽率最高，達73.0%，顯著高于S13、S20(P<0.05)，與其他17個采集地?zé)o顯著差異，S20發(fā)芽率最低，為67.0%，顯著低于S18(P<0.05)，與其他18個采集地?zé)o顯著差異。

低溫層積種子在不同發(fā)芽溫度下的發(fā)芽率差異性分析結(jié)果見表5，置床后150 d，15 ℃/25 ℃變溫條件下發(fā)芽率顯著高于20、25、15 ℃恒溫(P<0.05)。結(jié)果說明，低溫層積處理后種子發(fā)芽率提高，較為適宜的發(fā)芽培養(yǎng)溫度條件是15 ℃/25 ℃變溫。

表5 滇重樓層積種子在不同溫度下的發(fā)芽率差異性分析 %

2.4 滇重樓種子聚類分析

以千粒質(zhì)量、低溫層積種子在15 ℃/25 ℃變溫培養(yǎng)5個月的發(fā)芽率進行組內(nèi)聯(lián)接的平方歐氏距離聚類分析，結(jié)果見圖1。按滇重樓的產(chǎn)地來源可將其種子劃分為3類，第1類包括S1、S2、S3、S6、S7、S14、S17和S20，這8個產(chǎn)地滇重樓特點是種子粒徑小、質(zhì)量小、發(fā)芽率較低；第2類包括S4、S5、S9、S11、S12、S13、S16，這7個產(chǎn)地滇重樓特點是種子粒徑大、千粒質(zhì)量大、發(fā)芽率處于中等水平；第3類包括S8、S10、S15、S18和S19，這5個產(chǎn)地特點是種子中等大小、種子發(fā)芽率較高。

3 結(jié)論和討論

我國有重樓屬植物19種18變種，其中滇重樓和七葉一枝花分布較廣，分布區(qū)域包括云南、四川、貴州、湖北、甘肅等地[18]，本研究中20份種子的產(chǎn)地分別為云南、貴州、廣西，均是滇重樓主產(chǎn)區(qū)。由于各產(chǎn)地間的溫度、光照、降水量、土壤條件等環(huán)境條件各不相同，為適應(yīng)不同的環(huán)境條件，植物可能產(chǎn)生一些遺傳變異，并將穩(wěn)定的遺傳變異反映在種子品質(zhì)上[19]。對藥用植物來說，種子質(zhì)量是實現(xiàn)藥材高產(chǎn)高效栽培的基礎(chǔ)，更是保證藥材藥效品質(zhì)純正穩(wěn)定的源頭。因此，研究不同產(chǎn)地的種子質(zhì)量差異對研究不同產(chǎn)地環(huán)境下藥用植物品質(zhì)評價具有重要意義，也對優(yōu)良種質(zhì)篩選和高產(chǎn)高效栽培過程中種源產(chǎn)地劃分和引種地的選擇具有指導(dǎo)意義。

我國農(nóng)作物種子質(zhì)量評價體系常用的指標(biāo)是純度、凈度、水分和發(fā)芽率[20-22]，本研究首先測定了新鮮滇重樓種子的形態(tài)，包括種長、種寬和千粒質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)種子大小和質(zhì)量呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。然后對滇重樓種子發(fā)芽特性進行研究，發(fā)現(xiàn)新鮮種子在第5個月時仍未見發(fā)芽，8個月平均發(fā)芽率僅11.4%，低溫層積種子發(fā)芽率顯著提高，發(fā)芽時間縮短，尤其是發(fā)芽溫度為15 ℃/25 ℃變溫時，5個月的平均發(fā)芽率為69.8%。根據(jù)以上結(jié)果，在種長、種寬、千粒質(zhì)量等3個顯著性相關(guān)的指標(biāo)中選取千粒質(zhì)量，選取層積種子15 ℃/25 ℃發(fā)芽率，作為評價滇重樓種子質(zhì)量的主要指標(biāo)。綜合千粒質(zhì)量和發(fā)芽率指標(biāo)聚類分析，可將20個產(chǎn)地的滇重樓種子劃分為3類，第1類來源于貴州六盤水和云南文山，特點是種子小、發(fā)芽率低；第2類主要來源于廣西百色、云南文山，特點是種子大、發(fā)芽率中等水平；第3類來源于包括云南西北部和中部，特點是種子中等大小、種子發(fā)芽率偏高。

本研究僅從種子外觀大小、千粒質(zhì)量、發(fā)芽率上做了分析，在種子內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)、貯藏的營養(yǎng)物質(zhì)成分和含量以及轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和基因組等方面的差異有待以后進一步研究。