李向龍， 張中保， 張 春， 吳忠義

(北京市農(nóng)林科學院生物中心/北京市農(nóng)業(yè)基因資源與生物技術重點實驗室，北京 100097)

花粉管通道法于1983年由周光宇創(chuàng)立，因其無須組培和植株再生，且技術相對簡單、對設備要求低，在玉米轉(zhuǎn)基因育種中得到了廣泛應用[1-4]。該方法利用花絲授粉萌發(fā)形成的花粉管通道將生殖細胞的DNA輸入卵細胞并最終轉(zhuǎn)化成合子或早期胚胎細胞[5]。前人利用花粉管通道法進行玉米轉(zhuǎn)化并獲得了陽性植株[6-7]，轉(zhuǎn)化時間差異較大，從授粉后6～36 h開始轉(zhuǎn)化均有報道，可能是因為在實際操作過程中轉(zhuǎn)化材料和外界環(huán)境不同造成的。

玉米花粉管通道法通道打通時間段如何確定，是該方法獲得較高轉(zhuǎn)化效率的關鍵。張雅君等通過苯胺藍染色法和GeneFinderTM核酸染料對玉米花粉管伸長進程和導入路徑進行了研究[8-9]，但由于花粉管通道形成受很多自然因素影響，造成了通道形成時間在材料間有差異。由于花粉管通道只有完全打通，玉米才能正常結實，因此通過結實始末時間可以斷定通道打通至關閉的時間段，在該時間段進行外源DNA導入，轉(zhuǎn)化效率最高。本研究借助該思路對2個玉米試驗材料在不同月份、不同溫度下去除花絲，考察其結實粒數(shù)，初步確定其通道打開時間段、受溫度影響規(guī)律及最佳轉(zhuǎn)化時間，以期為花粉管通道法應用于玉米轉(zhuǎn)基因育種提供有效方法和指導依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地點設在海南省三亞市崖州區(qū)。本研究供試玉米材料為S173、S192，均由北京市農(nóng)林科學院生物中心選育，為近幾年花粉管通道法轉(zhuǎn)化試驗的骨干材料。

1.2 試驗設計

為觀察2個試驗材料間花粉管通道形成時間段及受溫度影響的規(guī)律，分別于2015年1月16—20日、3月1—5日、12月26—30日在2個玉米自交系開花前嚴格套袋，避免花粉提前落到花絲上；在花絲長至一定程度進行授粉，授粉后從3 h開始每隔2 h去除1次花絲，直至授粉后31 h結束，重復3次，每個重復6穗，以同時段授粉但不去除花絲的雌穗作為對照；記錄從授粉開始至去除花絲期間5 d的溫度。

在2015年12月、2016年1月對2個試驗材料通道形成時間規(guī)律進行初步驗證，設2個處理，處理1依據(jù)之前的經(jīng)驗在授粉后18 h進行轉(zhuǎn)化，處理2是根據(jù)分析結果依溫度變幅進行調(diào)整。2016年3月對收獲種子進行除草劑篩選，同時比較2個處理所得陽性株數(shù)。

1.3 試驗方法

不同處理去除花絲步驟為花絲未伸出苞葉前雌穗提前套袋；花絲露出苞葉達6～7 cm時開始授粉并再次套袋，標注授粉時間；用小刀將雌穗苞葉從頂部至底部切開(圖1-A)；注意不要傷及穗軸、弄斷苞葉底部與穗柄連接處，將花絲去除干凈(圖1-B)；將苞葉恢復原狀，頂部用皮筋扎好(圖1-C)，標注去除花絲時間；待授粉后20 d取回雌穗，進行結實粒數(shù)統(tǒng)計(圖1-D)，記錄從授粉開始至去除花絲期間的溫度。

使用Elitech RC-4HA溫度記錄儀記錄授粉至轉(zhuǎn)化期間的溫度，設定每隔15 min記錄1次；授粉后15 d統(tǒng)計去除花絲雌穗的結實粒數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel 2010進行整理和分析，并作圖表。

2 結果與分析

2.1 不同去除花絲時間對雌穗結實部位的影響

從表1中可以看出，2個材料從授粉至13 h均未結實，與對照表現(xiàn)相同，表明在該時間段內(nèi)其花粉管通道均未形成；2個材料雌穗結實部位與對照相似，均是從中部開始結實，再至中下部，最后整穗結實，該結果與前人就玉米雌穗結實順序研究結果[10]一致。2個材料及對照在3個月份中開始結實的順序依次是3、12、1月， 可能與這3個月中溫度逐漸降低有關；

表1 不同去除花絲時間對雌穗結實部位的影響

注：“—”表示未結實。

在相同月份內(nèi)，S192開始結實的時間段要早于S173，表明其花粉管通道形成的時間要早于S173，因此在利用花粉管通道法轉(zhuǎn)化該材料時，轉(zhuǎn)化時間要適當提前。

2.2 不同月份去除花絲時段的溫度變化

從圖2可以看出，相同月份去除花絲的5 d內(nèi)溫度變化不大，較為穩(wěn)定；不同月份去除花絲間日均溫度差異較大，3月最高，溫度在26.5～27.0 ℃之間，12月次之，溫度在 24.0～25.5 ℃ 之間，1月溫度最低，溫度在20.0～21.5 ℃之間，表明2個材料在3、12、1月間開始結實時間延遲與溫度變化有很大的關系。

2.3 去除花絲時間對雌穗結實粒數(shù)的影響

2.3.1 不同月份去除花絲時間對S173結實率的影響 由圖3可見，S173平均結實粒數(shù)在不同月份間都是隨著去除花絲時間的推移逐漸升高，1月是從21 h開始結實至27 h處于上升過程，29 h后變得平緩，說明花粉管通道是從21 h開始形成且通道數(shù)量逐漸增多；3月試驗時是從17 h開始結實，再往后結實粒數(shù)上升明顯，至21 h上升平緩，說明花粉管通道是從17 h開始形成然后通道數(shù)量逐漸增多；12月是從19 h開始結實，然后結實粒數(shù)逐漸升高，23 h后上升緩慢，表明花粉管通道是在該時間段內(nèi)數(shù)量較多。去除花絲試驗期間溫度由高到底的順序依次為3、12、1月，可見花粉管通道形成與溫度密切相關，溫度越高，花粉管通道形成越早，反之則形成延遲。

2.3.2 不同月份去除花絲時間對S192結實率的影響 由圖4可見，S192平均結實粒數(shù)在3次去除花絲中隨時間變化的趨勢與S173相似。1月結實粒數(shù)從19 h開始升高至25 h變得平緩，說明花粉管通道在此時段內(nèi)打通數(shù)量較多；12月結實粒數(shù)從17 h后開始逐漸升高，至23 h后變得平緩，表明通道數(shù)量在此時間段較多；3月其開始結實較前2個月早，從 15 h 開始結實，逐漸升高后至21 h開始變得平緩，說明此時段通道打通數(shù)量較多。結果表明，S192花粉管通道打通易受溫度影響，溫度升高花粉管通道打開時間提前，反之則延遲。

2.4 2個玉米材料最佳轉(zhuǎn)化時間確定

由表2可見，隨著溫度在1、12、3月3個月間不斷升高，2個玉米材料在授粉后的結實時間段均有提前的趨勢，說明溫度對2個玉米材料結實性有較大的影響，在溫度相近時，S192的結實時間段要早于S173。當日均溫度為20.0～21.5 ℃時，S173結實時間段為授粉后21～27 h，表明其花粉管通道形成在該時段內(nèi)處于高峰期，S192稍早，其花粉管通道形成是在授粉后19～25 h；當日均溫度為24.0～25.5 ℃時，S173花粉管通道形成在授粉后19～23 h，S192在授粉后 17～21 h間處于通道形成高峰期；當日均溫度為26.5～27.0 ℃ 時，S173花粉管通道授粉后17～21 h形成，S192花粉管通道在15～19 h間形成。表明花粉管通道形成時間受日均溫度影響較大，只有在上述溫度對應上述時間段時對2個玉米材料進行花粉管通道法轉(zhuǎn)化才能達到較高的轉(zhuǎn)化效果。

表2 不同溫度條件下2個玉米材料確定結實時間段

2.5 通道形成時間驗證

從表3中可以看出，S192在2015年12月處理1、處理2所得陽性轉(zhuǎn)化率相近，由于其轉(zhuǎn)化時間正好處于最佳轉(zhuǎn)化時間段內(nèi)。除此之外，其他處理在同期授粉和相同溫度下，處理2得到陽性轉(zhuǎn)化率均明顯高于處理1，表明通過去除花絲法確定花粉管通道形成時間是可行的。而在授粉時間和溫度均相同時，S173得到陽性轉(zhuǎn)化率略高于S192，說明花粉管通道法的轉(zhuǎn)化效率與受體材料有一定的關系。

3 結論與討論

玉米正常結實的前提是花粉管通道完全打通，而通道形成也須要一個過程，雖然在此過程中先形成的通道有關閉的，但還有不斷打通的，花粉管通道法須要在花粉管通道打通的高峰時間段進行轉(zhuǎn)化才能獲得較高的轉(zhuǎn)化效率。本試驗中2個材料在雌穗結實部位的順序依次為中部、中下部、頂部，在中下部結實時結實數(shù)較多，說明花粉管通道形成較多。

表3 2個材料在不同溫度和不同轉(zhuǎn)化時間條件下得到陽性株數(shù)

花粉管通道法在實際操作過程中受外界環(huán)境影響較大，如溫度、濕度、光照等，且月份間、年度間上述因素都會有差異。本試驗考察了溫度因素對結實的影響，當溫度較高時，2個材料結實起始時間較早，說明通道形成早，在實際轉(zhuǎn)化時要適當提前；反之，通道形成要慢些，轉(zhuǎn)化要相應推遲。

在對花粉管通道形成時間段進行驗證時，本試驗在確定的最佳時間內(nèi)(處理2)進行轉(zhuǎn)化，其陽性轉(zhuǎn)化率要高于處理1，說明利用去除花絲法確定花粉管通道形成時間是可行的；本試驗還發(fā)現(xiàn)S192在3個月份間結實時間早于S173，說明其花粉管通道形成要早于S173，表明試驗材料不同，通道形成時間會有差異，本試驗提供的是一種確定花粉管通道打通時間的方法，最終進行花粉管通道法轉(zhuǎn)化時還須因時、因地、因品種而進行適當?shù)男拚?/p>