邢界紅 劉慶玲 岳景茁 鄧偉明

(內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙藥股份有限公司，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(賽默飛，型號(hào)：U3000)、效液相色譜儀二極管陣列檢測(cè)器、電子天平(十萬(wàn)分之一 型號(hào)：CP225D)；

1.2 試劑與試藥 異硫氰酸苯酯(PITC)購(gòu)自北京百靈威科技有限公司 標(biāo)示純度≥98%；甘氨酸(批號(hào) 140689-201605)、丙氨酸(批號(hào) 040680-201303)、脯氨酸(批號(hào) 140677-201206)由中國(guó)食品藥品生物制品鑒定所提供；乙腈、乙酸鈉、鹽酸、三乙胺均為分析純，市售。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別 取本品粉末5g，置索氏提取器中，加乙醚70mL，加熱回流30min，溶液蒸干，殘?jiān)右颐?mL使溶解，作為供試品溶液。另取膽固醇對(duì)照品，加乙醚制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0502 )試驗(yàn)[1]，吸取上述2種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-丙酮(4:1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以乙醇-濃硫酸-醋酐(10:1:1)的溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖(5為對(duì)照品，9為陰性對(duì)照，其它為7批樣品)。

2.2 浸出物 取制牛鞭(批號(hào)：201608001)，分別照水溶性浸出物測(cè)定法和醇溶性浸出物測(cè)定法[2](《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2202)項(xiàng)下的冷浸法和熱浸法測(cè)定，浸出物結(jié)果顯示水熱浸法43.18%，水冷浸法35.98%；95%乙醇熱浸法15.60%，95%乙醇冷浸法12.30%；75%乙醇熱浸法21.28%，75%乙醇冷浸法17.99%，因水溶性熱浸出物含量較高且溶劑為水，故本品浸出物選擇采用水溶性浸出物測(cè)定方法的熱浸法測(cè)定，浸出物結(jié)果顯示，7批樣品水溶性熱浸出物的平均值為33.03% ，最高38.99% ，最低26.01%，因此將浸出物含量暫定為不得少于25.0%。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 方法 照高效液相色譜法(通則0512)測(cè)定：含量=CR× Ax /ARCR為對(duì)照品濃度、Ax為供試品峰面積、 AR為對(duì)照品濃度。

2.3.2 色譜條件[3]賽默飛高效液相色譜儀 型號(hào)(μLtimate3000)紫外∕二級(jí)管陣列檢測(cè)器 Chromeleon7工作站 色譜柱：①ΜLtimate plus SN:P18151625 C18(4.6mm×250mm)；②Thermo SN：10306598 C18(4.6mm×250mm)③Inertsustain SN:6LR98043 C18(4.6mm×250mm)；柱溫43℃；以乙腈-0.lmol·L-1乙酸鈉溶液(用乙酸調(diào)節(jié)p H 值至6.5)(7 : 93)為流動(dòng)相A ，以乙腈-水(4 : 1)為流動(dòng)相B ，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，進(jìn)樣量5μL。

表1 流動(dòng)相

表2顯示：研究組患者的殘余尿量(98.6±38.5)mL較對(duì)照組(136.3±52.2)mL明顯減少，切(P< 0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3.3 對(duì)照品溶液的制備 取甘氨酸對(duì)照品、丙氨酸對(duì)照品、脯氨酸對(duì)照品適量，精密稱定，加0.lmol·L-1鹽酸溶液制成每1mL含甘氨酸0.1mg·mL-1、丙氨酸對(duì)照品0.1mg·mL-1、脯氨酸0.1mg·mL-1的混合溶液，即得。

2.3.4 供試品溶液的制備 取本品(過(guò)三號(hào)篩)約0.25g，精密稱定，置25mL量瓶中，加0.1mol/L鹽酸溶液20mL，超聲處理(功率300W，頻率40kHz)30min，放冷，加0.lmol·L-1鹽酸溶液至刻度，搖勻。精密量取5mL，置20 mL安瓿中，加鹽酸5mL,150°C水解1h，放冷，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，用水10mL分次洗滌，洗液并入蒸發(fā)皿中，蒸干，殘?jiān)?.1mol·L-1鹽酸溶液使溶解，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中,加0.1mol·L-1鹽酸溶液至刻度，搖勻，即得。

精密量取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液各5mL，分別置25mL量瓶中，各加0.1mol·L-1異硫氰酸苯酯(PITC)的乙腈溶液2.5mL，lmol·L-1三乙胺的乙腈溶液2.5mL，搖勻，室溫放置1 h后，加50%乙腈至刻度，搖勻。精密吸取10mL，加正己烷10mL，振搖，放置10min，取下層溶液，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

空白溶液 取0.lmol·L-1鹽酸溶液5mL，精密量取上述對(duì)照品溶液和供試品溶液各5mL， “置25mL量瓶中，各加0.lmol·L-1異硫氰酸苯酯(PITC)的乙腈溶液2.5mL”起，依法測(cè)定含量，即得。

2.3.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 峰純度試驗(yàn)：采用高效液相色譜儀二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5μL，注入液相色譜儀，測(cè)得結(jié)果對(duì)照品與供試品色譜峰匹配值均大于95%。

分別吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶液各5μL，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果樣品色譜中甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸3個(gè)氨基酸色譜峰分離度良好,空白無(wú)干擾。

2.3.6 提取效率的考察 超聲時(shí)間考察 以0.1mol·L-1鹽酸溶液作為提取溶劑進(jìn)行超聲外理(功率300W，頻率40kHz)，為保證被測(cè)成分提取完全，實(shí)驗(yàn)中考察了超聲提取20min、30min、40min不同時(shí)間對(duì)提取效率的影呴，結(jié)果表明超聲處理20min、30min和40min含量基本一致，故超聲時(shí)間定為30min。

酸水解時(shí)間考察 在提取過(guò)程中，對(duì)柱前酸水解時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果可見(jiàn)，超聲水解30min、60min和90min含量基本一致，故水解時(shí)間定為60min。

2.3.7 線性關(guān)系考察 分別吸取上述對(duì)照品溶液2μL、5μL、8μL、10μL、12μL、15μL注入液相色譜儀，測(cè)得峰面積。分別以氨基酸對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。結(jié)果見(jiàn)下表2～4。

表2 線性關(guān)系考察—甘氨酸

表3 線性關(guān)系考察—丙氨酸

表4 線性關(guān)系考察—脯氨酸

分別以氨基酸對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。從而得出二者具有極好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r均大于0.999。

2.3.8 穩(wěn)定性 取供試品按上述色譜條件分別于0.3.6.9.12.h測(cè)定峰面積計(jì)算甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸3個(gè)氨基酸色譜峰峰面積的RSD分別為0.08%、0.32%、1.77% ，供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.9 精密度 取供試品溶液按照上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，測(cè)定峰面積甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸3個(gè)氨基酸的RSD分別為0.05%、0.09%、0.68%。結(jié)果表明，儀器的精密度良好。

2.3.10 重復(fù)性 取同一批次的制牛鞭6份，按含量測(cè)定項(xiàng)下方法操作，測(cè)定每份樣品的含量，甘氨酸平均含量40.73 mg·g-1， RSD%=0.56%；丙氨酸平均含量22.09 mg·g-1， RSD%=1.69%；脯氨酸平均含量23.54 mg·g-1， RSD%=0.37。

2.3.11 加樣回收試驗(yàn) 取甘氨酸對(duì)照品加0.1mol·L-1鹽酸制成每1mL含2.396mg的溶液，取丙氨酸對(duì)照品加0.1mol·L-1鹽酸制成每1mL含1.397mg的溶液，取甘氨酸對(duì)照品加0.1mol·L-1鹽酸制成每1mL含1.702mg的溶液，另取已知含量制牛鞭樣品(批號(hào)：201608005，甘氨酸含量40.73mg·g-1、丙氨酸含量22.09 mg·g-1、脯氨酸含量23.54 mg·g-1)約0.125g，共6份，精密稱定，分別加入上述甘氨酸對(duì)照品溶液2mL、丙氨酸對(duì)照品溶液3mL、脯氨酸對(duì)照品溶液2mL(約相當(dāng)于供試品含量的100%)，照前述方法測(cè)定，并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表5～7。

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果-甘氨酸

表6 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果-丙氨酸

表7 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果-脯氨酸

2.3.12 樣品測(cè)定 取制牛鞭樣品0.25g，精密稱定，按上述方法操作，并按干燥品計(jì)算含量。制牛鞭7批樣品的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表8～10。

樣品測(cè)定結(jié)果表明，7批樣品甘氨酸平均含量為38.98mg·g-1，丙氨酸平均含量26.75mg·g-1，脯氨酸平均含量22.65mg·g-1，按平均值的80%(-20%)制定含量限度甘氨酸31.18mg·g-1，丙氨酸21.4 mg·g-1，脯氨酸18.12 mg·g-1，取整數(shù)，限度暫定為甘氨酸30.0 mg·g-1，丙氨酸20.0 mg·g-1，脯氨酸18.0 mg·g-1。

表8 樣品測(cè)定試驗(yàn)—甘氨酸

表9 樣品測(cè)定試驗(yàn)—丙氨酸

表10 樣品測(cè)定試驗(yàn)—脯氨酸