楊雅欣 徐仕娟 馮小翠 羅國勇 張敬杰

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院 貴州省苗醫(yī)藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2. 貴陽中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

紫金龍為毛茛科烏頭屬植物深裂黃草烏(Aconitum vilmorinianum var. altifidum W. T. Wang)的根及根莖。收載于《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003版)。是苗族習(xí)用藥材，具有祛風(fēng)除濕，溫經(jīng)止痛的功效，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等病癥[1]。據(jù)文獻報道，該屬植物中的化學(xué)成分包括生物堿、黃酮、甾體及糖苷類等，其中有效成分及特征成分主要為二萜生物堿類[2-4]。因二萜生物堿類化合物廣泛的生物活性，一直是藥物學(xué)家尋找新藥的一個重要來源[5]。

目前，未見紫金龍總生物堿含量測定的文獻報道。酸性染料比色法是測定中藥總生物堿含量的一種經(jīng)典方法[6-7]，本文擬通過紫外-可見分光光度計，利用酸性染料比色法測定苗藥紫金龍中總生物堿的含量。旨在建立紫金龍?zhí)崛∥镏锌偵飰A含量測定的方法，為其質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 紫外可見分光光度計(UV-500，上海元析儀器有限公司)，超聲波清洗器(SK8210HP，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)，恒溫水浴鍋(DRHH，上海雙捷實驗設(shè)備有限公司)，分析天平(AR2140，上海奧豪斯有限公司)。

1.2 試藥 烏頭堿對照品(302-27-2，貴州迪大科技有限責(zé)任公司，純度≥98%)；無水乙醇(分析純，天津市富宇精細化工有限公司)，石油醚(分析純，天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)，正丁醇(分析純,天津市富宇精細化工有限公司)，氯仿(分析純，西隴化工股份有限公司)，甲醇，氫氧化鈉等均為分析純；溴甲酚綠(指示劑,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，實驗用水為蒸餾水。

1.3 藥材 藥材購自貴陽市萬東橋中藥市場，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物深裂黃草烏Aconitum vilmorinianum var. altifidum W. T. Wang的根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 試液溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 精密稱取紫金龍藥材粉末(過60目篩)2.0g于25mL的圓底燒瓶中，按紫金龍最佳提取方案[8]，加入固液比1:8 的65%乙醇溶液16mL，85℃水浴回流提取2.5h，冷卻，過濾，70℃蒸干溶劑，浸膏加入75%乙醇15mL使之溶解，轉(zhuǎn)入分液漏斗中，分別用等體積的石油醚、氯仿、正丁醇依次萃取3次，合并萃取液，取氯仿萃取液所得浸膏用75%乙醇5mL溶解至完全，精密量取0.3mL于5ml容量瓶中，75%乙醇定容至刻度，即得供試品溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取烏頭堿對照品5.0mg，甲醇定容至5mL，制得1.0mg/mL對照品貯備液，逐級稀釋，得到0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg/mL的烏頭堿對照品溶液。

2.1.3 酸料染料的制備[9]0.05mol/L氫氧化鈉溶液的配制：精密稱取氫氧化鈉0.2g于100mL錐形瓶中，加入蒸餾水使之溶解并稀釋至刻度，即得。

溴甲酚綠緩沖液的配制：精密稱取溴甲酚綠0.1g，加入0.05mol/L氫氧化鈉2.8mL使之溶解，再加水稀釋至200mL，即得。

2.2 測定條件的選擇

2.2.1 酸性染料的顯色方法 精密吸取烏頭堿對照品或供試品溶液1.2mL置60mL的分液漏斗中，分別加入溴甲酚綠溶液24mL和氯仿12mL，密塞劇烈振搖20min，靜置分層10min，取氯仿層進行紫外-可見光檢測。

2.2.2 測定波長的選擇 以2.1.1，2.1.2的方法分別制備供試品及對照品溶液，并按照2.2.1的顯色方法顯色，在190～800nm波長范圍內(nèi)進行光譜掃描，考察吸收波長。結(jié)果表明，供試品在410～420nm處有最大吸收，烏頭堿對照品在410～415nm處有最大吸收峰，綜合考慮，最終選擇415nm作為實驗檢測波長。

2.3 酸性染料比色法的方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取烏頭堿對照品5.0mg，甲醇定容至5mL，制得1.0mg/mL對照品貯備液，逐級稀釋，得到0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg/mL的烏頭堿對照品溶液。分別精密吸取1.2mL置60mL的分液漏斗中，加入溴甲酚綠溶液24mL和氯仿12mL，密塞劇烈振搖20min，靜置分層10min，取氯仿層于415nm波長處測定吸光度值。以對照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制曲線，得回歸方程為Y=2.76X+0.0386(r=0.999，n=5)。結(jié)果表明，烏頭堿的濃度在0.1mg/mL-0.3mg/mL范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗 精密吸取濃度為0.2mg/mL的烏頭堿對照品置于分液漏斗中，按“2.2.1”項下的操作方法，取氯仿層于415nm波長處測定吸光度，連續(xù)測定6次，測得RSD = 0.74%，說明儀器所測得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

2.3.3 重現(xiàn)性試驗 取同一批紫金龍藥材細粉6份，每份2.0g，按照“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液6份，每份1.2mL，依“2.2.1”項下方法處理顯色后，于415nm波長處測定吸光度，結(jié)果紫金龍中總生物堿平均含量為7.82mg/g，RSD = 1.43%，表明實驗方法重現(xiàn)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液1.2mL，依“2.2.1”項下方法處理顯色后，分別在0,20,40,60，80,100min于415nm波長處測定吸光度，結(jié)果RSD = 0.80%，表明供試品溶液在100min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的紫金龍藥材粉末6份，分別加入等量烏頭堿對照品，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，依“2.2.1”項下方法處理顯色后，于415nm波長處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 紫金龍總生物堿加樣回收率測定結(jié)果

2.3 樣品的含量測定 取4個批次的紫金龍?zhí)崛∥?，每個批次平行測定3次，每次精密量取1.2mL，依“2.2.1”項下進行酸性染料比色，取氯仿層于415nm波長處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算紫金龍總生物堿的含量，得出紫金龍中總生物堿平均含量為7.27mg/g。

表2 紫金龍?zhí)崛∥镏锌偵飰A含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

酸性染料比色法是生物堿類化合物與氫離子生產(chǎn)陽離子，酸性染料比色與其定量結(jié)合成有色絡(luò)合物，被有機溶劑提取，在一定波長處測定其吸光度，即可計算總生物堿的含量[6]。酸性染料比色法所測定的結(jié)果較準(zhǔn)確，應(yīng)用較多。

本實驗采用酸性染料比色法，通過紫外-可見分光光度計檢測對苗藥紫金龍藥材總生物堿進行定量分析，建立其中總生物堿含量測定的方案。測得紫金龍?zhí)崛∥镏锌偵飰A的含量平均為7.27 mg/g。該方法具有一定的專屬性和準(zhǔn)確度，靈敏度高，簡便易行，適宜紫金龍藥材中總生物堿含量測定。