吳燕燕 徐偉芳 羅 琴 王玲莉 劉祎楊 陳 凱 謝 潔

(西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715)

桑樹(MorusL.)是一種兼具經(jīng)濟(jì)與生態(tài)效益的樹種，在中國(guó)蠶業(yè)發(fā)展和環(huán)境治理等方面均具重要作用。桑椹(Mulberry fruit)是桑樹的果實(shí)，因其口感獨(dú)特、滋味頗佳、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)而深受大眾喜愛。桑椹中含有大量黃酮和多酚類活性物質(zhì)，具有提高免疫力、抗氧化和抗衰老等功效[1-4]，近年來(lái)果桑產(chǎn)業(yè)呈現(xiàn)出良好的發(fā)展勢(shì)頭。然而，隨著果桑種植面積的不斷擴(kuò)大，桑椹菌核病對(duì)果桑產(chǎn)業(yè)的危害日趨嚴(yán)重，給果桑生產(chǎn)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失。桑椹菌核病，又稱白果病，是一種土傳真菌性病害，可由桑實(shí)杯盤菌(Ciboriashiraiana)[5]、肉阜狀杯盤菌(Ciboriacarunculoides)[6]、桑椹核地杖菌(Scleromitrulashiraiana)[7]以及核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)[8]等多種病原真菌引起。有關(guān)桑樹抗病性的調(diào)查結(jié)果中顯示，不同桑樹品種對(duì)菌核病抗性差異較大。江西省蠶桑茶葉研究所果桑園內(nèi)5個(gè)桑樹品種中，臺(tái)果46C019發(fā)病程度最輕，抗病性最強(qiáng)[9]；黃傳書等通過(guò)對(duì)重慶市蠶業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院桑園內(nèi)16個(gè)果桑品種的桑椹菌核病抗性能力的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，川桑7637抗性最強(qiáng)，紅果2號(hào)抗性最弱[10]；魏曉軍選育出的抗性品種臺(tái)灣46C019和蘇椹72號(hào)對(duì)防治桑椹菌核病的效果頗佳[11]?？剐杂N是目前防治菌核病的有效方法之一，但該防治策略仍存在“選育時(shí)間長(zhǎng)、人力投入大及部分抗性品種果質(zhì)與經(jīng)濟(jì)性狀欠佳”等一系列弊端。化學(xué)防治與農(nóng)藝防治亦是生產(chǎn)上常用的防控手段，但農(nóng)藥濫用易威脅食品與環(huán)境安全，土地翻耕等農(nóng)藝防控效果不佳[12]。因此，尋找綠色環(huán)保、安全有效的防治方法已迫在眉睫。

植物內(nèi)生菌是指其生活史中的某一段時(shí)期生活在健康植物各組織器官的細(xì)胞間隙或者細(xì)胞內(nèi)部，不引起宿主植物發(fā)生明顯病害的一類微生物[13-14]。內(nèi)生細(xì)菌作為宿主植物的重要組成部分，對(duì)調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)的微生態(tài)平衡以及促進(jìn)宿主植物的健康生長(zhǎng)均發(fā)揮重要作用。近些年來(lái)利用內(nèi)生細(xì)菌防控植物病害的研究報(bào)道較多，但在實(shí)際生產(chǎn)中能夠廣泛應(yīng)用的生防菌株卻十分有限[15-16]。為尋找抑菌效果顯著且穩(wěn)定的拮抗菌株，了解宿主植物內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性特征十分必要。目前關(guān)于內(nèi)生菌多樣性的研究方法主要有基于傳統(tǒng)手段的組織分離培養(yǎng)法，以及基于宏基因組測(cè)序技術(shù)的非培養(yǎng)法，且至今所鑒定的內(nèi)生菌大多數(shù)依靠培養(yǎng)法分離獲得[17]。自然環(huán)境中存在大量的微生物，其數(shù)量高達(dá)106種，迄今依靠傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法能夠分離培養(yǎng)的微生物僅占總數(shù)的1.0%，而原核生物僅為0.1%[18]，利用傳統(tǒng)培養(yǎng)法研究植物內(nèi)生菌的多樣性存在明顯局限。大量未培養(yǎng)微生物(即難以在實(shí)驗(yàn)室條件下生長(zhǎng)的微生物)的存在嚴(yán)重制約了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對(duì)植物內(nèi)生菌資源的全面認(rèn)識(shí)。因此，避開傳統(tǒng)培養(yǎng)方法帶來(lái)的弊端，依靠分子生物學(xué)手段的非培養(yǎng)法應(yīng)運(yùn)而生。有報(bào)道顯示，植物內(nèi)生菌的分布特征與其定殖宿主植物的種類或品種緊密相關(guān)[19-25]。論文研究基于不同桑樹品種對(duì)菌核病菌抗性差異顯著的特點(diǎn)，利用基于Illumina MiSeq的第二代高通量測(cè)序技術(shù)，探索不同品種桑樹內(nèi)生菌的種群分布特征及多樣性，并探究?jī)?nèi)生菌的分布與宿主植物抗病性之間是否存在相關(guān)性，為利用內(nèi)生菌改變宿主特性，開展抗病育種提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試桑樹材料

紅果2號(hào)、川桑7637、新倫教三種果桑品種樣品于2015年4月上旬采自重慶市蠶業(yè)科學(xué)研究院桑園(29°50′39″N, 106°25′55″E)，長(zhǎng)果桑于同一時(shí)間段采自重慶市西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院桑園“桑之源”(29°49′1″N, 106°24′57″E)。每個(gè)桑樹品種采集3～5個(gè)長(zhǎng)勢(shì)一致的兩年生健康枝條，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑和儀器

DNA marker、Taq酶、dNTP、10×PCR Buffer、Mg2+購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；QIAquick凝膠回收試劑盒購(gòu)于QIAGEN公司；其余常規(guī)化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；PCR儀(Bio-Rad，美國(guó))，Applied Biosystems?Gene Amp?PCR System 9700(Bio-Rad，美國(guó))等。

1.2 方法

1.2.1 桑樹表面消毒

按照文獻(xiàn)[26-28]的方法進(jìn)行桑樹的表面消毒，具體操作方法為：將桑枝剪成5cm莖段，流水沖洗晾干后，完全浸潤(rùn)于75.0%乙醇中，取出后于酒精燈上燃盡莖段表面的乙醇，將其置于PDA培養(yǎng)基上滾動(dòng)一周，使莖段表面均接觸培養(yǎng)基，將該P(yáng)DA平板置于22℃培養(yǎng)48h，確認(rèn)表面消毒徹底。

1.2.2 內(nèi)生菌富集與宏基因組DNA提取

內(nèi)生菌富集[29-30]：將20g消毒的桑樹樹皮剪碎，加入160mL無(wú)菌水，置于組織搗碎機(jī)搗碎后，紗布過(guò)濾離心 (200×g，5min，4℃)，取上清130mL，依次加入NaCl和SDS分別至終濃度為0.9%，0.063%，輕輕混勻后4℃靜置1h，取上清離心(5000×g，10min，4℃)，然后將所獲沉淀重懸于160mL無(wú)菌水，再按上述濃度加SDS和NaCl，靜置30min，4℃離心10min(5000×g)，收集的沉淀即為富集的菌體，將其按30mg/ mL的比例加入TE緩沖液懸浮備用。

以富集的菌體為材料，參考文獻(xiàn)[28]中的改良CTAB法提取宏基因組DNA，并以此為模板，利用引物799F (5’-AACAGGATTAGATACCCTG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，50℃退火45s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)[31-32]，將獲得單一且明亮條帶的擴(kuò)增16S rRNA基因產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的總DNA樣品視為合格樣品，并將濃度≥50ng/uL的DNA樣品送至成都羅寧生物科技有限公司進(jìn)行上機(jī)測(cè)序與后續(xù)生物信息分析。

1.2.3 PCR擴(kuò)增、Miseq文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序

以1.2.2確定的合格基因組DNA為模板，利用16S rDNA V3-V4區(qū)特異引物338F/806R，使用高效和高保真酶(TOYOBO KOD-Plus-Neo DNA Polymerase)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、QIAquick凝膠回收試劑盒(QIAGEN公司)回收擴(kuò)增產(chǎn)物，并使用GE Nano Vue系統(tǒng)(GE Healthcare)進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。利用Illumina MiSeq平臺(tái)(Illumina，SanDiego，USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建雙末端讀長(zhǎng)(PE，Paired-end Reads)2×300的文庫(kù)并測(cè)序。

1.2.4 生物信息分析流程

Miseq測(cè)序得到的雙端序列數(shù)據(jù)，首先根據(jù)PE之間的重疊關(guān)系，利用FLASH軟件拼接[33]、QIIME軟件過(guò)濾[34]、UCHIME去除嵌合體后[35]，得到有效優(yōu)化序列。然后利用UPARSE算法對(duì)優(yōu)化序列在97%水平上進(jìn)行OTU聚類分析[36]，挑選出OTU代表性序列，并利用Greengene和Silva等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋[37-38]，去除注釋為葉綠體、線粒體及非細(xì)菌界的OTUs。最后利用Mother軟件做稀釋曲線分析[39]，通過(guò)對(duì)OTU進(jìn)行豐度和α-多樣性分析，得到微生物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性特征。

圖中C、Q、X、H分別代表長(zhǎng)果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號(hào)，M代表DNA marker 2000圖1 富集菌體DNA的質(zhì)量檢測(cè)

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌宏基因組DNA的提取

提取的桑樹樹皮組織總DNA片段較為完整，基因組片段大于15kb。通過(guò)細(xì)菌16S rDNA V6～V10區(qū)特異性PCR擴(kuò)增，均獲得大小為750bp左右的目的片段(圖1)。經(jīng)表面消毒的桑枝滾動(dòng)的培養(yǎng)基在培養(yǎng)后，于22℃溫度下培養(yǎng)48h，無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果為合格的桑樹內(nèi)生菌的基因組。

2.2 序列長(zhǎng)度分布

從4個(gè)桑樹品種中共測(cè)得128715條PE，經(jīng)拼接和過(guò)濾處理后，獲得92282條優(yōu)化序列，除新倫教外，其余3個(gè)品種得到的優(yōu)化序列均超過(guò)2萬(wàn)條(表1)，且所有桑樹品種的優(yōu)化序列長(zhǎng)度集中分布在420～429bp范圍內(nèi)(圖2)，約占總序列的90.02%。

表1 樣品序列長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)表

圖2桑樹內(nèi)生細(xì)菌擴(kuò)增序列長(zhǎng)度分布情況

2.3 OTU數(shù)目統(tǒng)計(jì)

從4個(gè)果桑樣品中共獲得5858個(gè)細(xì)菌OTUs，不同品種桑樹OTU數(shù)量存在差異(圖3)：抗性品種川桑7637的內(nèi)生細(xì)菌OTU數(shù)最高，可達(dá)2228個(gè)，長(zhǎng)果桑次之，含1907個(gè)OTUs，易感品種紅果2號(hào)(1739)和新倫教(1713)則整體相對(duì)較低。4個(gè)品種共有內(nèi)生細(xì)菌OTUs數(shù)為239個(gè)，遠(yuǎn)低于各品種果桑特有內(nèi)生細(xì)菌OTUs數(shù)(川桑7637，1513個(gè)；長(zhǎng)果桑，1209個(gè)；紅果2號(hào)，1060個(gè)；新倫教，1034個(gè))。

圖3 (A)不同品種桑樹內(nèi)生菌OTU分布Venn圖,(B)不同品種桑樹內(nèi)生細(xì)菌OTU數(shù)目統(tǒng)計(jì);圖中C、Q、X、H分別代表長(zhǎng)果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號(hào)

2.4 樣品多樣性分析

基于OTU的稀釋曲線結(jié)果顯示，隨著測(cè)序數(shù)量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，趨于平坦，且所有樣品均已進(jìn)入平臺(tái)期，說(shuō)明測(cè)序數(shù)量已經(jīng)足夠大，可以基本反映樣品中絕大多數(shù)微生物信息(圖4)。另外，基于Shannon和Chao1多樣性指數(shù)曲線結(jié)果顯示4個(gè)樣本的多樣性指數(shù)差異較大，川桑7637>長(zhǎng)果桑>新倫教>紅果2號(hào)，即桑椹菌核病抗性品種川桑7637內(nèi)生細(xì)菌的種群豐富度最大，多樣性最高，其次是長(zhǎng)果桑，而易感品種新倫教和紅果2號(hào)種群豐富度和多樣性相對(duì)較低。

圖4 不同桑樹品種的稀釋曲線和多樣性指數(shù)曲線；C、X、Q、H分別代表長(zhǎng)果桑、新倫教、川桑7637、紅果2號(hào)

2.5 群落結(jié)構(gòu)組成分析

在門的分類水平看(圖5A)，4個(gè)桑樹樣品中共檢測(cè)出細(xì)菌21個(gè)門(相對(duì)豐度≥0.1%)，不同品種桑樹所測(cè)到的細(xì)菌種類相似，但在各品種中所占比例不同。整體而言，數(shù)量最多的5個(gè)門為變形菌門(Proteobacteria，36.10%)、厚壁菌門(Firmicutes，14.51%)、酸桿菌門(Acidobacteria，13.38%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，11.85%)以及放線菌門(Actinobacteria，6.35%)，尤以變形菌門的優(yōu)勢(shì)最為明顯，其在長(zhǎng)果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號(hào)各品種中所占比例分別為74.17%、68.87%、78.90%和79.97%。盡管浮霉?fàn)罹T(Planctomycetes，3.86%)、綠彎菌門(Chloroflexi，3.72%)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes，1.21%)和疣微菌門(Verrucomicrobia，1.18%)等常見的門類細(xì)菌含量較少，但在所有桑樹樣品中均有一定比例的分布。

在綱的分類水平看(圖5B)，4個(gè)桑樹樣品共檢測(cè)出細(xì)菌18個(gè)綱(相對(duì)豐度≥0.5%)。γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria，14.48%)、α-變形菌綱(Alphaproteobacteria，13.21%)、梭菌綱(Clostridia，11.93%)、擬桿菌綱(Bacteroidia，7.48%)4個(gè)綱所占比例較大。其中，γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)的優(yōu)勢(shì)尤為明顯，其在長(zhǎng)果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號(hào)各品種中所占比例分別為62.40%、48.38%、59.24%和50.34%；α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)次之，其在紅果2號(hào)中可達(dá)26.89%，在長(zhǎng)果桑、新倫教中所占比例均大于8%。

在目的分類水平看(圖5C)，從長(zhǎng)果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號(hào)4個(gè)桑樹樣品中共檢測(cè)出梭菌目(Clostridiales，11.74%)、假單胞菌目(Pseudomonadales，8.59%)、根瘤菌目(Rhizobiales，8.04%)、(Bacteroidales，7.48%)等22個(gè)目(相對(duì)豐度≥0.5%)。假單胞菌目是所有品種桑樹的優(yōu)勢(shì)菌目，其在長(zhǎng)果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號(hào)中所占比例分別為57.91%、42.65%、54.30%和45.63%。鞘脂單胞菌目(Sphingomonadales)在不同品種桑樹中所占的比例差異較大，其在長(zhǎng)果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號(hào)各品種中所占比例分別為5.12%、2.69%、12.19%和23.96%。

在科的分類水平看(圖5D)，假單胞菌科(Pseudomonadaceae，8.35%)、鞘氨醇單胞菌科(Sphingomonadaceae，2.00%)，腸桿菌科(Enterobacteriaceae，1.83%)、擬桿菌(Bacteroidaceae，1.23%)和甲基桿菌科(Methylobacteriaceae，0.92%)等25個(gè)科在4個(gè)桑樹品種內(nèi)生細(xì)菌中均有分布(相對(duì)豐度≥0.5%)。甲基桿菌科在川桑7637中所占比例較大(4.78%)，而在紅果2號(hào)內(nèi)的比例卻不足1%。

圖5 不同樣本在不同水平上的細(xì)菌群落組成。(A)門，(B)7綱，(C)目，(D)科；圖中 C、X、Q、H分別代表長(zhǎng)果桑、新倫教、川桑7637、紅果2號(hào)

屬水平上的細(xì)菌種群分布特征顯示，4個(gè)桑樹樣品共有3857條序列被視為未知序列或尚未被分類到屬的序列，這些無(wú)法歸類的序列占總序列數(shù)的65.84%，說(shuō)明還有很多潛在新菌種待發(fā)現(xiàn)。在可歸類序列中，主要分布于假單胞菌屬(Pseudomonas，8.01%)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas，1.78%)、擬桿菌屬(Bacteroides，1.14%)、芽孢桿菌屬(Bacillus，0.77%)以及甲基桿菌屬(Methylobacterium，0.75%)，且這些菌屬在不同樣品中所占比例有所差異。對(duì)豐度最高的前40個(gè)OTUs分析發(fā)現(xiàn)(表2)，假單胞菌屬為所有品種桑樹中所占比例最大的菌屬，其在長(zhǎng)果桑、川桑7637、新倫教、紅果2號(hào)中所占比例分別為57.89%、43.08%、54.47%、45.81%，是果桑優(yōu)勢(shì)菌屬；甲基桿菌屬(Methylobacterium)在川桑7637中所占比例較大(4.79%)，而在其他三個(gè)品種果桑內(nèi)的比例卻不足1%；嗜血桿菌屬(Haemophilus)、巨單胞菌屬(Megamonas)等菌屬亦在桑樹中占有一定的比例。

表2 不同品種桑樹內(nèi)生細(xì)菌在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)組成

表中“g__”表示在門或科水平上無(wú)法歸類的屬。

3 討論與分析

植物內(nèi)生菌種類繁多，廣泛存在于植物的各種器官和組織中，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)宿主植物生長(zhǎng)發(fā)育發(fā)揮重要作用。已有報(bào)道顯示，內(nèi)生菌的多樣性與植物種類、季節(jié)以及生長(zhǎng)的地理環(huán)境等因素息息相關(guān)[40-41]。本研究調(diào)查了四個(gè)不同果桑品種內(nèi)生菌多樣性特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，川桑7637、長(zhǎng)果桑、新倫教和紅果2號(hào)這4個(gè)桑樹樣品均富含大量?jī)?nèi)生細(xì)菌，各品種間的群落結(jié)構(gòu)組成相似，但多樣性特征存在較大差異，抗性品種(川桑7637及長(zhǎng)果桑)的內(nèi)生菌群多樣性顯著高于易感品種(紅果2號(hào)及新倫教)。此現(xiàn)象表明桑樹內(nèi)生菌的種群分布亦受宿主基因型的影響，推測(cè)菌體對(duì)宿主的這種選擇偏好性可能與宿主自身的生理結(jié)構(gòu)、營(yíng)養(yǎng)代謝途徑以及其分泌的次生代謝產(chǎn)物有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)室前期利用培養(yǎng)法對(duì)桐鄉(xiāng)青桑樹品種內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)組成的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)是主要的桑樹內(nèi)生菌資源[28]。然而，本研究利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)4個(gè)桑樹品種內(nèi)生菌多樣性進(jìn)行調(diào)查分析顯示，四個(gè)桑樹品種均含21個(gè)門類細(xì)菌，其中變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)以及放線菌門(Actinobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌群。通過(guò)傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法所發(fā)現(xiàn)的植物內(nèi)生細(xì)菌種類及數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于高通量測(cè)序得到的菌群數(shù)量，說(shuō)明大量低豐度菌群及未培養(yǎng)微生物在培養(yǎng)法分離中被忽略，而未培養(yǎng)微生物中蘊(yùn)藏著大量的未知功能基因和生物潛能，在生物能源開發(fā)利用和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用潛力[42]，Illumina MiSeq的第二代高通量測(cè)序技術(shù)具有測(cè)序通量高，操作簡(jiǎn)單快速，測(cè)序信息準(zhǔn)確和成本低等特點(diǎn)，為低豐度及未培養(yǎng)微生物的研究帶來(lái)了新的思路和方式。

本研究利用基于Illumina MiSeq的第二代高通量測(cè)序技術(shù)，比較了桑椹菌核病不同抗性桑樹品種的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性特征，解決了不可培養(yǎng)及低豐度菌種在傳統(tǒng)方法中無(wú)法鑒別的局限。后續(xù)研究將在本研究基礎(chǔ)上通過(guò)改良菌株的培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)方法等手段，盡可能富集到更多的內(nèi)生菌資源，并從多樣的桑樹內(nèi)生菌資源庫(kù)中分離篩選具高效穩(wěn)定抑菌功效的拮抗菌株，為桑樹病害的生物防治提供參考依據(jù)。