左婕，嚴(yán)琳，王安，陳啟月，伍紅

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

纖維素酶是降解天然纖維素生成葡萄糖的一組酶的總稱[1]，其主要來(lái)源為微生物。里氏木霉菌（Trichoderma reesei）為好氧絲狀真菌，在工業(yè)上用于生產(chǎn)分解不同植物材料的酶類[2]，是公認(rèn)的產(chǎn)纖維素酶最高的菌株之一[3]，具有產(chǎn)量高、易培養(yǎng)、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[4]。透明顫菌為專性好氧革蘭氏陰性絲狀菌，在低氧環(huán)境中能夠合成可溶性的透明顫菌血紅蛋白（VHb）而旺盛生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氧濃度較低時(shí)，該蛋白可以結(jié)合氧增大表達(dá)量，提高宿主菌攝氧和能量利用效率，使宿主菌在限氧條件下保持高水平的細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)合成，在工程菌中得到廣泛運(yùn)用[5-7]。

本試驗(yàn)比較了轉(zhuǎn)透明顫菌血紅蛋白基因里氏木霉菌株和普通里氏木霉菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的能力，并利用響應(yīng)面法[8-11]優(yōu)化了轉(zhuǎn)透明顫菌血紅蛋白基因里氏木霉菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件，為該基因工程菌株在未來(lái)生產(chǎn)實(shí)際中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 轉(zhuǎn)透明顫菌血紅蛋白基因里氏木霉Tu6-VHb菌株、里氏木霉Tu6菌株，均由中國(guó)科學(xué)院微生物研究所提供。

1.1.2 斜面培養(yǎng)基 馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉20g、尿苷1.221g，蒸餾水1000mL，pH值自然。

1.1.3 固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基 向不同碳源配比的固體培養(yǎng)物中（固體發(fā)酵培養(yǎng)基總量為4g）加入不同氮源配比的Mandels營(yíng)養(yǎng)液（營(yíng)養(yǎng)液氮源添加總量為2.5g/L）及尿苷（1.221g/L）。

1.2 方法

1.2.1 固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶 吸取已保存菌液于PDA培養(yǎng)基平板中央，30℃恒溫培養(yǎng)6～7 d。待孢子成熟，加入適量生理鹽水過(guò)濾除去菌絲體，并計(jì)數(shù)得到1×106個(gè)/mL孢子懸浮液，按6%的體積分?jǐn)?shù)接種于固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)72h。

1.2.2 提取纖維素酶粗酶液 固體發(fā)酵結(jié)束后加入40mL醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH值4.8），30℃振蕩提取60min，隨后將溶液以8 000 r/min離心10min，取上清液。

1.2.3 纖維素酶活力測(cè)定 向試管中加入0.5mL粗酶液和1 mL pH值4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液，預(yù)熱到50℃，加入50mg濾紙條，50℃水浴60min后加入3mL DNS，煮沸5 min，冰上冷卻，加蒸餾水定容至25mL，540nm波長(zhǎng)測(cè)OD值，計(jì)算酶活。纖維素酶濾紙酶活力的定義：在pH值4.8、溫度50℃條件下，每分鐘催化底物水解生成1μg葡萄糖的酶量為1個(gè)活力單位U。

1.2.4 Plackett-Burman試驗(yàn)（P-B試驗(yàn)） 取單因素，分別為碳源配比、氮源配比、初始含水量、接種量、發(fā)酵時(shí)間、吐溫-80含量、初始pH值，設(shè)高低兩個(gè)水平，以濾紙酶活力為指標(biāo)，通過(guò)SPASS對(duì)單因素?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行分析，然后用Design expert 8.0進(jìn)行P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)，篩選出影響Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的3個(gè)重要因素。

1.2.5 最陡爬坡試驗(yàn) 響應(yīng)面只有在臨近最佳值時(shí)才能建立有效的響應(yīng)面方程。最陡爬坡法以響應(yīng)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较颍鶕?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長(zhǎng)，快速逼近最大響應(yīng)區(qū)域。

1.2.6 響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)（B-B試驗(yàn)） B-B試驗(yàn)采用響應(yīng)面法，設(shè)計(jì)對(duì)Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的分析試驗(yàn)。根據(jù)擬合出的二次多項(xiàng)式，得到預(yù)測(cè)值和最佳發(fā)酵條件。響應(yīng)面回歸模型為：

式子中，Y 為預(yù)測(cè)響應(yīng)值，β0為截距，βi、βii、βij為回歸系數(shù)，Xi、Xj為各個(gè)因素。

用Design expert 8.0軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，確定最佳發(fā)酵條件，依據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面圖和等高線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tu6-VHb菌株和Tu6菌株產(chǎn)纖維素酶活力的比較與分析 Tu6-VHb菌株和Tu6菌株在相同培養(yǎng)條件下發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶，測(cè)得的濾紙酶活力見(jiàn)圖1。

圖1 Tu6-VHb和Tu6在120h內(nèi)所產(chǎn)酶活力的比較

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，酶活力均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，成功轉(zhuǎn)入VHb基因的Tu6-VHb菌株在120 h內(nèi)的最高酶活為40.23U/g，而Tu6菌株的最高酶活為24.45 U/g，說(shuō)明Tu6-VHb菌株比Tu6菌株具有更強(qiáng)的產(chǎn)酶能力。Tu6-VHb菌株固體培養(yǎng)第72h時(shí)酶活達(dá)到最高，因此以Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵72h為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。

2.2 Plackett-Burman（P-B）試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析 用Design expert 8.0軟件設(shè)計(jì)的P-B試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1，P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)及纖維素酶濾紙酶活力的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2，試驗(yàn)各因素分析結(jié)果見(jiàn)表3，各因素正負(fù)效應(yīng)圖見(jiàn)圖2。

由圖、表可知，按影響Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的程度，各因素的重要性從高到低依次為碳源配比、初始pH值、氮源配比、初始含水量、吐溫-80、接種量、發(fā)酵時(shí)間。其中，初始含水量、吐溫-80、接種量、發(fā)酵時(shí)間影響為負(fù)效應(yīng)，碳源配比、初始pH值、氮源配比影響為正效應(yīng)。因此，確定碳源配比、初始pH值及氮源配比為最陡爬坡試驗(yàn)的重要因素。

表1 P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素及其水平

表2 P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)及酶活測(cè)定結(jié)果

表3 P-B試驗(yàn)分析結(jié)果

圖2 P-B試驗(yàn)各因數(shù)的正負(fù)效應(yīng)圖

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 由P-B試驗(yàn)可知3個(gè)重要因素的影響均為正效應(yīng)，因此設(shè)計(jì)各因素水平依次遞增的最陡爬坡試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及酶活測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表4可知，在最陡爬坡試驗(yàn)中，隨著碳源配比、初始pH值和氮源配比各因素水平不斷遞增，相對(duì)應(yīng)的酶活呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)碳源配比為3：1，初始pH值為5，氮源配比為1時(shí)，對(duì)應(yīng)的酶活達(dá)到最高（121.51 U/g），可作為3因素響應(yīng)的最大值區(qū)域。由此確定3因素最適水平，并以此設(shè)計(jì)后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.4 Box-Behnken（B-B）試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.4.1 B-B試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以3因素最適水平為中心值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)的3因素3水平，見(jiàn)表5。

2.4.2 B-B試驗(yàn)結(jié)果與分析 依據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行固體發(fā)酵，以纖維素酶濾紙酶活力為指標(biāo)進(jìn)行分析。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及酶活測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6，試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表7。

表5 B-B試驗(yàn)因素及其水平

表6 B-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)及酶活測(cè)定結(jié)果

表7 B-B試驗(yàn)結(jié)果回歸分析

由表7可知，該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.8841，說(shuō)明88.41%的試驗(yàn)結(jié)果可由該模型解釋，建立的模型較為準(zhǔn)確；回歸模型 P值=0.014 2（P＜0.05），模型顯著。失擬性P值=0.0717（P＞0.05），失擬性不顯著，模型沒(méi)有失擬現(xiàn)象。模型的線性、平方的影響是顯著的，交互作用影響不顯著。

經(jīng)過(guò)回歸擬合后，得到回歸方程：

酶活（U/g）=128.33-4.34×A-1.61×B-10.86×C-6.57×A×B-2.57×A×C-10.94×B×C-19.50×A2-13.00×B2-27.57×C2

式中，A為碳源配比，B為初始pH值，C為氮源配比。

根據(jù)該回歸方程，當(dāng) A=2.89、B=5.02、C=0.90時(shí)，模型預(yù)測(cè)最大響應(yīng)值R=129.61U/g。

2.4.3 響應(yīng)面分析 根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果畫出3個(gè)因素兩兩之間的響應(yīng)曲面，其中曲面最高點(diǎn)表示酶活最大值；再繪出等高線密度圖，根據(jù)等高線密集程度判斷兩因素對(duì)產(chǎn)酶的影響。

從畫出的響應(yīng)曲面圖可知，當(dāng)?shù)磁浔葹?.02時(shí)，碳源配比從2.00遞增到4.00，初始pH值從4.50遞增到5.50，測(cè)得纖維素酶酶活先增大后減小，二者交互影響，構(gòu)成一個(gè)曲面，曲面最高點(diǎn)為酶活力最大值；當(dāng)初始pH值為0.90時(shí)，碳源配比從2.00遞增到4.00，氮源配比從0.50遞增到1.50，測(cè)得纖維素酶酶活先增大后減小，二者交互影響，構(gòu)成一個(gè)曲面，曲面最高點(diǎn)為酶活力最大值；當(dāng)碳源配比為2.89時(shí)，初始pH值從4.5遞增到5.50，氮源配比從0.50遞增到1.50，測(cè)得纖維素酶酶活先增大后減小，二者交互影響，構(gòu)成一個(gè)曲面，曲面最高點(diǎn)為酶活力最大值。

由等高線密度圖觀察可得，碳源配比的等高線密度高于初始pH值的等高線密度，表明碳源配比對(duì)Tu6-VHb菌株產(chǎn)纖維素酶的影響大于初始pH值的影響；碳源配比的等高線密度要高于氮源配比的等高線密度，表明碳源配比對(duì)Tu6-VHb菌株產(chǎn)纖維素酶的影響大于氮源配比的影響；初始pH值的等高線密度高于氮源配比的等高線密度，表明初始pH值對(duì)Tu6-VHb菌株產(chǎn)纖維素酶的影響大于氮源配比的影響。該結(jié)果亦與P-B試驗(yàn)的結(jié)果相一致。

2.4.4 模型驗(yàn)證 由響應(yīng)面試驗(yàn)預(yù)測(cè)出Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最大酶活力為129.61 U/g。按照 A=2.89、B=5.02、C=0.90 進(jìn)行 3組重復(fù)試驗(yàn)，取平均值得123.81U/g，與預(yù)測(cè)值相近，證明模型有效。由此，根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化得到Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的最佳培養(yǎng)條件為：碳源配比（即麩皮與稻谷桿的比例）為2.89，初始pH值為5.02，氮源配比（即尿素與硫酸銨的比例）為0.90。

3 結(jié)論

用于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的方法很多，如單因素法、正交法及響應(yīng)面法。響應(yīng)面法是一種考慮多因素交互作用并找到最佳組合及作用水平的優(yōu)化法，是目前國(guó)內(nèi)外常用的一種方法。

Tu6-VHb菌株由于向Trichoderma reesei中轉(zhuǎn)入了VHb基因，增強(qiáng)了Tu6-VHb菌株的呼吸頻率，促進(jìn)了Tu6-VHb菌株在限氧條件下的生長(zhǎng)繁殖，有利于Tu6-VHb菌株進(jìn)行固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶。Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵產(chǎn)酶量較Tu6菌株提高了61%。在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，對(duì)Tu6-VHb菌株固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行了響應(yīng)面法優(yōu)化，最終得到最佳產(chǎn)酶條件為：碳源配比（即麩皮與稻谷桿的比例，固體發(fā)酵培養(yǎng)基總量為4g）為2.89，初始pH值為5.02，氮源配比（即尿素與硫酸銨的比例，Mandels營(yíng)養(yǎng)液氮源添加總量為2.5g/L）為0.90。在此最佳條件下發(fā)酵產(chǎn)酶，每克培養(yǎng)基平均可產(chǎn)纖維素酶123.81U，比未優(yōu)化前（每克培養(yǎng)基產(chǎn)纖維素酶40.23U）提高了3.08倍。