翁文玉 郝燁華 張瑜生 周志昆

廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 東莞 523808

骨質(zhì)疏松(osteoporosis,OP)是老年人和絕經(jīng)后女性中常發(fā)生的全身性代謝性骨病，以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)遭到損壞，導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征[1]。隨著人口老齡化的增加，OP已成為一個日趨嚴(yán)重的公共健康問題，給許多國家?guī)砹顺林氐慕?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。截至2017年，中國60歲及以上人口達(dá)到2.41億人，占總?cè)丝诘?7.3%[3]。在美國和歐洲，有30%的女性患有骨質(zhì)疏松癥，40%的絕經(jīng)后婦女和30%的男性經(jīng)歷過骨質(zhì)疏松性骨折[4]。因此，如何有效地預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的迫切問題。

有研究表明骨量的保持不僅取決于破骨細(xì)胞的吸收功能和成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)的成骨功能，還取決于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的產(chǎn)生率和凋亡率的差異[5]，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的異常凋亡被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松發(fā)病的重要致病機(jī)制，其中，成骨細(xì)胞凋亡的增加和成骨細(xì)胞數(shù)量的下降被認(rèn)為是引起骨量丟失的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制[5]，因此，預(yù)防成骨細(xì)胞的凋亡也將成為治療骨質(zhì)疏松的有效策略。

目前，細(xì)胞凋亡的途徑主要有三條：線粒體途徑、死亡受體途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑，其中，線粒體途徑是主要的凋亡途徑[6]。 線粒體介導(dǎo)的凋亡信號通路的激活誘導(dǎo)OB凋亡，促進(jìn)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[7]。因此，探索OB經(jīng)線粒體途徑凋亡的分子機(jī)制，對于研究OP的發(fā)病機(jī)制，以及預(yù)防和治療OP具有重要意義。近年研究表明，成骨細(xì)胞經(jīng)線粒體途徑凋亡的相關(guān)信號通路有：磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3- kinase，PI3k)/Akt、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、Ca2+/CaM和其他信號通路等。

本文通過綜述線粒體途徑相關(guān)信號通路和因子對OB凋亡的作用，來為進(jìn)一步研究安全、有效的抗骨質(zhì)疏松藥物提供依據(jù)和新的作用靶點。

1 線粒體途徑介導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡

線粒體既是細(xì)胞生命活動的控制中心，也是細(xì)胞凋亡的中心[8]。線粒體跨膜電位 ΔΨm的下降是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的第一步[7]。眾多凋亡誘導(dǎo)因素導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔(MPT)破壞或開放，ΔΨm下降，線粒體通透性增強(qiáng)，促進(jìn)了細(xì)胞色素C(Cyt C)和細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)從線粒體中釋放，從而激活線粒體的半胱天冬酶(caspase)依賴性和非依賴性凋亡途徑[7,9]。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的Cyt C特異性地結(jié)合接頭蛋白Apaf-1，同時直接募集大量caspase 9并使之活化，進(jìn)而誘導(dǎo)caspase級聯(lián)反應(yīng)，激活 caspase 3，切割聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(poly-ADP-ribose polymerase，PARP，一種DNA修復(fù)酶)，引發(fā)不可逆的caspase依賴性細(xì)胞凋亡[7]。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的AIF 聚集，易位到細(xì)胞核，引起DNA斷裂，從而激活了線粒體caspase非依賴性凋亡途徑[9]。

在線粒體途徑介導(dǎo)的凋亡過程中，Bcl-2 蛋白家族的活性與其密切相關(guān)。 Bcl-2蛋白家族位于線粒體外膜上，根據(jù)其功能和結(jié)構(gòu)上不同分為三個亞家族：①促凋亡BH3唯一蛋白(Bad、Bid、Bik、Bim、Bmf、Hrk、NOXA、PUMA等)，②抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-W、Mcl-1、BFL-1/A1)，③促凋亡效應(yīng)分子(Bax、Bak、Bok)[10]。眾多研究表明，線粒體內(nèi)Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達(dá)的增加會抑制成骨細(xì)胞凋亡，而Bad、Bax、Bak、Bim等蛋白表達(dá)的增加則會促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡[7,11-12]。Jilka等[5]敲除大鼠的Bak和Bax基因進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，Bak和Bax基因缺乏的大鼠中成骨細(xì)胞凋亡的數(shù)量顯著減少。

線粒體是活性氧(ROS)的重要來源，如：超氧化物(O2-)和過氧化氫(H2O2)，而過量的ROS會誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞線粒體的呼吸鏈，引起線粒體功能障礙[13]。過量ROS可以激活Bid，改變線粒體膜通透性，促使Cyt C釋放，引起細(xì)胞凋亡[14]?？梢?，過量ROS引起的氧化應(yīng)激會引起依賴于線粒體的細(xì)胞凋亡。

2 線粒體途徑相關(guān)信號通路對成骨細(xì)胞凋亡的作用

2.1 PI3k/Akt信號通路與成骨細(xì)胞凋亡

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是一種具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶雙重活性的脂類激酶，由調(diào)節(jié)性p85亞基和催化性p110亞基組成[15]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶Akt又稱為蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，擁有一個PH域。當(dāng)生長因子和細(xì)胞因子等一系列細(xì)胞外信號與受體酪氨酸激酶(RTK)和G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)結(jié)合時，酪氨酸殘基發(fā)生自身磷酸化，PI3K的p85亞基進(jìn)入到質(zhì)膜的內(nèi)表面，催化細(xì)胞膜內(nèi)層的磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)被p110亞基磷酸化，形成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)，PIP3分別與Akt和三磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(PDK1)的PH域結(jié)合，使 Akt的S124、T450位點磷酸化和使PDK1磷酸化，磷酸化的PDK1 和哺乳動物雷帕霉素目標(biāo)復(fù)合物(mTORC2)再分別使Akt的T308、S473位點磷酸化，從而完全激活A(yù)kt[16]。激活后的Akt作用于下游因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動。

當(dāng)PI3k/Akt信號通路激活后，進(jìn)而作用于線粒體途徑的Bcl-2蛋白，從而主導(dǎo)成骨細(xì)胞經(jīng)線粒體途徑的凋亡。丹參素通過上調(diào)PI3k/Akt信號通路，減少了MC3T3-E1成骨細(xì)胞中促進(jìn)凋亡的相關(guān)蛋白Bax、AIF、Cyt C的表達(dá)，從而抑制成骨細(xì)胞凋亡[17]。而PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002可以下調(diào)p-Bad的表達(dá)，上調(diào)Bad的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)了Bax/Bcl-2(促進(jìn)Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá))和caspase-3的表達(dá)，結(jié)果表明PI3K/Akt途徑的失活通過下調(diào)p-Bad來部分阻斷成骨細(xì)胞中的抗凋亡作用[18]。Bin等[19]研究也表明，流體切應(yīng)力抗TNF-α導(dǎo)致的成骨細(xì)胞凋亡，激活 PI3k/Akt 信號通路，活化的Akt使FoxO3a磷酸化，降低Bim和caspase-3的表達(dá)。綜合這些研究表明，由PI3k激活的Akt，可以進(jìn)一步通過抑制 Bad、Bim、Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)，促進(jìn)Bcl-2和Bcl-xL抗凋亡蛋白的表達(dá)，減少線粒體途徑Cyt C、AIF、caspase-9、 caspase-3等相關(guān)促凋亡分子的表達(dá)，抑制OB經(jīng)線粒體途徑的凋亡。

此外，PI3k/Akt還可以與其他信號通路相互作用，可以進(jìn)一步激活FoxO3a[19]、CREB[20]等多種轉(zhuǎn)錄因子，從而抵抗氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的線粒體功能障礙，抑制OB的凋亡。因此，PI3k/Akt信號通路是預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵性靶點。

2.2 MAPK信號通路與成骨細(xì)胞凋亡

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路是由MAPK激酶激酶(MAPKKK)、MAPK激酶(MAPKK/MEK/MKK)和MAPK組成的三步連續(xù)磷酸化級聯(lián)，三者又分別含有不同的亞族， MAPKKK含有Raf亞族(B-Raf、A-Raf、Raf-1)、MEKK亞族(MEKK1-4)、 ASK1和MST，MAPKK含有MEK1/2、MKK3和MKK6，MAPK含有ERK1/2、ERK5、p38、JNK等亞族[15]。四種主要的MAPKs： JNK、ERK1/2、ERK5、和p38被各種生物和物理化學(xué)應(yīng)激物激活后，在應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞增殖、分化，細(xì)胞因子產(chǎn)生和細(xì)胞的生存、凋亡等[21]。

2.2.1MAPK/JNK信號通路與成骨細(xì)胞凋亡：MAPK/c-Jun N末端激酶(JNK)信號通路是由ASK1、MEKK1激活MKK4/7，進(jìn)而激活JNK1/2/3,活化的JNK激活下游因子，引起一系列細(xì)胞生命活動[15]。眾多研究顯示，當(dāng)MAPK/JNK信號通路被激活時，JNK的磷酸化狀態(tài)顯著增加，c-Jun的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，JNK進(jìn)而抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，而促進(jìn)促凋亡蛋白(Bax，caspase9，caspase3和相關(guān)凋亡因子配體)的增加，從而調(diào)控OB凋亡[22]。Guo等[23]研究表明，脂多糖(LPS)通過激活JNK途徑，顯著提高了p-JNK的蛋白水平，降低了MC3T3-E1成骨細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá),上調(diào)了Bax和caspase-3的mRNA的表達(dá)，激活caspase-3的活性，誘導(dǎo)OB經(jīng)線粒體途徑凋亡。JNK特異性抑制劑SP600125的預(yù)處理則可增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，抑制 Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到線粒體，阻斷線粒體中Cyt C的釋放和caspase-3的激活，抑制成骨細(xì)胞凋亡[24]。可見，MAPK/JNK信號通路促進(jìn)OB經(jīng)線粒體途徑凋亡，而阻斷該信號通路的傳導(dǎo)可以是一種抗OB凋亡的有效手段。

2.2.2MAPK/ERK1/2信號通路與成骨細(xì)胞凋亡：MAPK/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2信號通路由Raf同工酶B-Raf、A-Raf、Raf1激活MEK1/2，再進(jìn)一步激活ERK1/2，進(jìn)而作用于下游因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞活動[15]。目前，有研究表明，MAPK/ERK1/2信號通路會抑制成骨細(xì)胞的凋亡。Chen等[25]研究表明，姜黃素通過激活ERK1/2通路，上調(diào)p-ERK1/2的表達(dá)，抑制由地塞米松(Dex)誘導(dǎo)的Bcl-2下調(diào)和Bax上調(diào)，從而抑制線粒體中Cyt C的釋放，抑制Caspase-3的激活和其導(dǎo)致的PARP的裂解，最終抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)OB免受Dex誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Zhu等[26]研究也表明，Vaspin促進(jìn)ERK1/2磷酸化，上調(diào)Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)Bax的表達(dá)，降低人成骨細(xì)胞的凋亡。而另一部分研究卻表明，ERK1/2信號通路會促進(jìn)成骨細(xì)胞的凋亡。Nam等[27]研究表明，槲皮素通過激活ERK引起線粒體依賴性機(jī)制誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡,ERK1/2活化，促進(jìn)Bax的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Zhao等[28]研究也表明，鎘(Cd)可以誘導(dǎo)OB的凋亡，通過增加 ERK1/2的磷酸化，降低線粒體跨膜電位 ΔΨm，增強(qiáng) caspase-3的活性，而ERK1/2抑制劑(U0126)則消除了Cd誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這些研究顯示，MAPK/ERK1/2信號通路參與了OB經(jīng)線粒體途徑的凋亡，但其對于凋亡的具體作用存在一定爭議，其調(diào)控機(jī)制尚不十分明確。

2.2.3MAPK/ERK5信號通路與成骨細(xì)胞凋亡：MAPK/ 細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶5(ERK5，也稱為BMK1)信號通路由MEKK2/3激活MEK5，進(jìn)而激活ERK5，活化的ERK5作用下游因子，也參與了抗凋亡的途徑[21]。Bin等[29]研究表明，流體剪切應(yīng)力(FSS)通過激活ERK5信號通路阻斷TNF-α誘導(dǎo)的MC3T3-E1成骨細(xì)胞凋亡，活化的ERK5可以從細(xì)胞質(zhì)穿梭至細(xì)胞核，導(dǎo)致Bad磷酸化,p-Bad被細(xì)胞質(zhì)中的14-3-3蛋白質(zhì)隔離，阻止其轉(zhuǎn)移至線粒體，抑制Bad，從而抑制其誘導(dǎo)的線粒體途徑caspase-3的活化。此外，Bin等[19]研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SS通過激活p-ERK5，進(jìn)一步激活p-Akt，活化FOXO3a，從而減少Bim的表達(dá)，抗TNF導(dǎo)致的OB凋亡。這些結(jié)果提示ERK5信號通路在FSS介導(dǎo)的成骨細(xì)胞抗凋亡作用中發(fā)揮重要作用。因此，ERK5信號通路可能成為抗骨質(zhì)疏松癥新藥的一個治療靶點。

2.2.4MAPK/p38信號通路與成骨細(xì)胞凋亡：MAPK/p38信號通路由ASK1、TAK1激活MKK3/6，再進(jìn)一步激活p38[15]。Yang等[30]研究表明，白介素(IL-1α)可以增加p38-MAPK的磷酸化，下調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)，而顯著上調(diào)Bax和caspase-3的mRNA表達(dá)和蛋白水平，促進(jìn)OB經(jīng)線粒體途徑的凋亡。Guo等[31]研究表明，用槲皮素預(yù)處理下調(diào)p-p38MAPK蛋白的表達(dá)，則顯著恢復(fù)了Bcl-2和Bcl-xL的下降表達(dá)，降低了Bax的表達(dá)，從而抑制了Cyt C和caspase-3的表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的OB經(jīng)線粒體凋亡途徑的凋亡。可見，這些藥物或因子通過激活或抑制MAPK/p38信號通路，進(jìn)而影響B(tài)cl-2家族蛋白的活性，發(fā)揮著促進(jìn)或抑制OB經(jīng)線粒體途徑的凋亡的作用。

2.3 Ca2+/ CaM信號通路與成骨細(xì)胞凋亡

Ca2+/ CaM信號通路的激活是由細(xì)胞外信號與受體結(jié)合，激活GPCRs，進(jìn)而激活磷脂酶C(PLC)，活化的PLC使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)分解為DAG和三磷酸肌醇(IP3)，后者作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)IP3受體，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+釋放，胞液中Ca2+濃度增加，激活鈣調(diào)蛋白(CaM)形成Ca2+/CaM復(fù)合物，進(jìn)而使鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaM-PK)磷酸化，作用于下游因子，引起生理效應(yīng)。

Ha等[32]研究表明，Cd激活Ca2+/CaM信號通路，破壞細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的平衡，使Ca2+增加，促進(jìn)Ca2+/CaM復(fù)合物的形成，Ca2+/CaM復(fù)合物激活三個效應(yīng)蛋白：鈣調(diào)蛋白依賴性磷酸二酯酶(CaM-PDE)、鈣調(diào)蛋白依賴性激酶激酶(CAMKK)和鈣調(diào)蛋白依賴性激酶II(CAMKII)。其中，活化的PDE激活ERK，誘導(dǎo)OB凋亡，而活化的CAMKK，則抑制ERK，抑制OB凋亡。另有研究表明，AlCl3使細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加，促進(jìn)Ca2+/ CaM復(fù)合物的形成，進(jìn)而使CaMKII磷酸化，活化的p-CaMKII誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，破壞線粒體呼吸鏈，引起OB凋亡[33]。可見，Ca2+/ CaM信號通路會與ERK交互作用來發(fā)揮對OB的抗凋亡或促凋亡作用。

2.4 其他信號通路和因子與成骨細(xì)胞凋亡

2.4.1Keap1/Nrf2信號通路：Keap1-Nrf2信號通路在保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損害方面發(fā)揮著重要作用[34]。Liu等[35]的研究表明，SFP激活Keap1-Nrf2信號通路，促進(jìn)其下游因子HO1和NQO1增加，從而減弱Dex誘導(dǎo)的caspase活化、PARP切割，即通過調(diào)節(jié)Nrf2途徑來抑制Dex誘導(dǎo)ROS過量產(chǎn)生的OB凋亡。

圖1 OB經(jīng)線粒體途徑凋亡及其相關(guān)的各信號通路和因子的作用示意圖。Fig.1 The schematic diagram of the apoptosis of OB by mitochondrial pathway and the effects of its related signaling pathways and factors

2.4.2PHB：抗增值蛋白(PHB，包括PHB1和PHB2)是位于線粒體內(nèi)膜一種蛋白質(zhì)，與氧化應(yīng)激的產(chǎn)生有關(guān)，PHB 1與PHB 2的相互作用對呼吸鏈和線粒體膜通透性的穩(wěn)定起著重要作用[36]。Sripathi等[37]研究發(fā)現(xiàn)，敲除PHB基因，可以上調(diào)促凋亡因子(BAK和caspases)的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡分子Bcl-xL的表達(dá)。而PHB的過表達(dá)卻會下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，引起凋亡[38]。同時，PHB還與多條信號通路有關(guān)，如Akt2、CaMK可以激活PHB，而PHB則可以作用于PI3K/Akt、Raf/MEK/ERK信號通路、CytC和Bcl-2等[36]。此外，抗骨質(zhì)疏松藥物黃芪三仙湯和艾香湯劑均能引起OB中PHB表達(dá)的明顯差異[39-40]。這些研究表明PHB參與了抑制或促進(jìn)線粒體途徑凋亡的過程，PHB可以作為研究抗骨質(zhì)疏松藥物的一個新靶點。

2.4.3Fox O家族：Fox O家族是一個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)器，與多種功能細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白質(zhì)有關(guān)，主要包括四個成員：Fox O1、Fox O3a、Fox O4和Fox O6[41]。其中，F(xiàn)ox O3a與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，F(xiàn)ox O3a由Akt直接激活[41]。流體切應(yīng)力抗TNF-α誘導(dǎo)的OB凋亡，激活PI3k/Akt信號通路，Akt1使Fox O3a磷酸化，p-Fox O3a抑制Bim的表達(dá)，減少caspase-3，從而抵御氧化應(yīng)激，抗OB凋亡[19]。

2.4.4cAMP/CREB：cAMP/CREB轉(zhuǎn)錄因子的Ser133位點能夠被Akt/PKB磷酸化，p-CREB促進(jìn)Bcl-2、Mcl-1的表達(dá)[42]，抑制抗霉素A(AMA)誘導(dǎo)的線粒體功能障礙，從而阻止OB凋亡[20]。

3 結(jié)語

綜上所述，線粒體途徑相關(guān)的眾多信號通路與因子對OB的凋亡發(fā)揮著促進(jìn)或抑制的作用(如圖1所示)。其中PI3k/Akt、MAPK/ERK5信號通路的激活，MAPK/JNK、MAPK/p38等信號通路的抑制，是抑制OB凋亡，防治骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵，因此，Akt、ERK、JNK、p38、Ca2+、PHB、FoxO3a、CREB、Keap1/Nrf2等因子可以作為研究抗骨質(zhì)疏松藥物的關(guān)鍵作用靶點。