葉大林 謝平金 魏合偉 柴生颋 劉海全 梁桂洪

1.廣州中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510104 2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東 廣州 510405

膝骨性關節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是在力學因素和生物學因素的共同作用下導致軟骨細胞、細胞外基質、軟骨下基質三者降解和合成失衡的一種慢性、進展性關節(jié)疾病[1]。其病理以關節(jié)軟骨退變、軟骨下骨硬化與骨贅形成為特點[2]。KOA與多種因素有關，其發(fā)病率也逐漸升高，所造成的關節(jié)功能障礙嚴重影響了生活質量，而其病因和發(fā)病機制尚未完全明確。本研究通過切除實驗大鼠雙側膝關節(jié)的前交叉韌帶、內側副韌帶及內側半月板建立KOA大鼠模型，探討補腎活血方調控BMP-2及Smad-1/5在KOA軟骨下骨骨重建過程的變化水平，以進一步研究補腎活血方在KOA軟骨下骨骨重建過程中的作用機制，為其臨床應用提供參考價值及理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物：SPF 級健康6月齡雌性SD大鼠24只，體重180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.1.2主要試劑：BMP-2試劑盒、Smad-1/5試劑盒購自廣州市齊云生物技術有限公司。

1.1.3藥物制備： 補腎活血方(桑寄生30 g，雞血藤30 g，阿膠(烊化)20 g，補骨脂20 g，懷牛膝20 g，龜板30 g，丹參10 g，熟地黃30 g，仙鶴草10 g，地龍15 g，當歸10 g，黃芪30 g，白芍30 g)，加水浸泡30 min后，文火煎煮1 h，過濾取出藥汁，加水復煎0.5 h，合并2次濾液，取上清液加熱濃縮，其提取物按照人與大鼠體表面積折算，含生藥量0.8 377 g/mL(由廣州中醫(yī)藥大學附屬骨傷科醫(yī)院制劑室提供)。

1.2 方法

1.2.1分組與造模： 將動物隨機分為假手術組、模型對照組和治療組，每組8只，用10%水合氯醛麻醉大鼠后，參考改良Hulth造模法[3]，模型對照組和治療組均切斷雙側膝關節(jié)的前交叉韌帶、內側副韌帶及內側半月板，徹底止血，逐層縫合；假手術組切開雙膝關節(jié)處皮膚，不切斷韌帶。術后分籠飼養(yǎng)，術后連續(xù)4 d給予青霉素溶液 4 萬U/d肌注。

1.2.2干預方法：術后第 4 周，開始灌胃給藥治療，治療組灌服補腎活血方2 mL，模型對照組及假手術組灌服等量的生理鹽水，每天1次，連續(xù)灌胃8周。

1.2.3檢測指標：(1)OA軟骨下骨骨組織內BMP2、Smad-1/5的動態(tài)變化檢測：分別于給藥后4、8周隨機選取3只大鼠右側脛骨，置于10%多聚甲醛固定、脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋，制作成骨長軸方向切片，采用SABC法免疫組化染色，測量BMP-2及Smad-l/5不同時間點的表達水平。每張切片隨機選5個視野(x400)，用倒置顯微鏡(Olympus IX70)觀察軟骨下骨組織并拍照，采用MOTC6.0圖像分析軟件(廈門麥克奧迪有限公司)對每張照片進行BMP-2及Smad-l/5表達的陽性細胞計數及進行灰度值測量。測量前需進行：①空間定標：將刻有已知直徑圓圈的標尺，在400倍鏡下采集150I|tm圓圈圖像，以備圖像分析時空間定標時使用。②亮度定標：采用SMR103黑白標準密度片(中國計量科學研究院)，在400倍鏡下連續(xù)采集21個級數密度圖象，以備圖像分析時亮度定標使用。每張、每組切片取其平均值，試驗以PBS替代一抗作陰性對照。陽性判斷標準：當細胞膜，胞漿和或細胞核出現棕黃色陽性物質為陽性細胞。用平均灰度值表示染色強弱。(2)軟骨下骨骨組織計量檢測：于灌胃8周后，處死大鼠，取大鼠左側脛骨,進行固定、脫水、不脫鈣骨硬組織包埋。包埋塊用硬組織切片機分別切下9 μm切片，直接封片,采用HMIAS22000圖像分析系統(tǒng)(廣州中醫(yī)藥大學國家重點實驗室)行軟骨下骨組織形態(tài)計量分析。每例標本3張，每張隨機取6個視野，測量后取平均值。測量參數包括：①骨體積(BV/TV)：測量范圍內骨小梁體積占全部骨組織體積的百分比，反映骨小梁分布密度；②骨小梁厚度(Tb.Th)；(2000/1.199)×(骨小梁面積/骨小梁周長)；③骨小梁密度(Tb.N)：(1.199/2)×(骨小梁周長/骨小梁面積)；④骨小梁分離度(Tb.Sp)：(2000/1.199)×([總面積-骨小梁面積] /骨小梁周長)。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 軟骨下骨骨組織計量檢測

假手術組、治療組在BV/TV、Tb.N上明顯低于模型對照組(P<0.05)，在Tb.Th、Tb.Sp上明顯高于模型對照組(P<0.05)。假手術組與治療組Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp上比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組軟骨下骨組織計量學分析比較Table 1 Comparison of bone histomorphometry of the subchondral bone among the

注：與假手術組對比：▲P<0.05；與模型對照組對比：△P<0.05。

2.2 OA軟骨下骨骨組織內BMP2、Smad-1/5的變化

給藥后4、8周各組BMP-2 圖像變化結果，見圖1～6。

圖1 給藥后4周模型對照組脛骨干骺端BMP-2(免疫組化染色，×400)Fig.1 Immunohistological staining of BMP-2 in the epiphysis of the tibia in the model control group after 4-week drug administration (×400)

圖2 給藥后4周假手術組脛骨干骺端BMP-2(免疫組化染色，×400)Fig.2 Immunohistological staining of BMP-2 in the epiphysis of the tibia in the sham operation group after 4-week drug administration (×400)

圖3 給藥后4周治療組脛骨干骺端BMP-2(免疫組化染色，×400)Fig.3 Immunohistological staining of BMP-2 in the epiphysis of the tibia in the treatment group after 4-week drug administration (×400)

圖4 給藥后8周模型對照組脛骨干骺端BMP-2(免疫組化染色，×400)Fig.4 Immunohistological staining of BMP-2 in the epiphysis of the tibia in the model control group after 8-week drug administration (×400)

圖5 給藥后8周假手術組脛骨干骺端BMP-2(免疫組化染色，×400)Fig.5 Immunohistological staining of BMP-2 in the epiphysis of the tibia in the sham operation group after 8-week drug administration (×400)

圖6 給藥后8周治療組脛骨干骺端BMP-2(免疫組化染色，×400)Fig.6 Immunohistological staining of BMP-2 in the epiphysis of the tibia in the treatment group after 8-week drug administration (×400)

由圖1-6，可見用藥4周，治療組BMP-2 陽性細胞個數較模型對照組增加，較假手術組有所減少；用藥8周，治療組較模型對照組顯著增加。

給藥后4、8周各組Smad-1/5 圖像變化結果，見圖7～12。

圖7 給藥后4周模型對照組脛骨干骺端Smad-1/5(免疫組化染色，×400)Fig.7 Immunohistological staining of Smad-1/5 in the epiphysis of the tibia in the model control group after 4-week drug administration (×400)

圖8 給藥后4周假手術組脛骨干骺端Smad-1/5(免疫組化染色，×400)Fig.8 Immunohistological staining of Smad-1/5 in the epiphysis of the tibia in the sham operation group after 4-week drug administration (×400)

圖9 給藥后4周治療組脛骨干骺端Smad-1/5(免疫組化染色，×400)Fig.9 Immunohistological staining of Smad-1/5 in the epiphysis of the tibia in the treatment group after 4-week drug administration (×400)

圖10 給藥后8周模型對照組脛骨干骺端Smad-1/5(免疫組化染色，×400)Fig.10 Immunohistological staining of Smad-1/5 in the epiphysis of the tibia in the model control group after 8-week drug administration (×400)

圖11 給藥后8周假手術組脛骨干骺端Smad-1/5(免疫組化染色，×400)Fig.11 Immunohistological staining of Smad-1/5 in the epiphysis of the tibia in the sham operation group after 8-week drug administration (×400)

圖12 給藥后8周治療組脛骨干骺端Smad-1/5(免疫組化染色，×400)Fig.12 Immunohistological staining of Smad-1/5 in the epiphysis of the tibia in the treatment group after 4-week drug administration (×400)

由圖7～12，用藥4周，治療組Smad-1/5陽性細胞個數較模型對照組增加，較假手術組有所減少，差異無統(tǒng)計學意義；用藥8周，治療組較模型對照組顯著增加。

2.3 不同時段各組BMP-2 灰度值及陽性細胞個數變化結果

用藥4周，治療組BMP-2 灰度值及陽性細胞個數較模型對照組增加(P<0.05)，較假手術組有所減少，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；用藥8周，治療組較模型對照組顯著增加(P<0.05)，較假手術組增加(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠脛骨上端軟骨下骨BMP-2灰度值及陽性細胞個數

注：與假手術組對比：▲P<0.05；與模型對照組對比：△P<0.05; 與治療后4周對比：*P<0.05。

2.4 不同時段各組Smad-1/5灰度值及陽性細胞個數變化結果

用藥4周，治療組Smad-1/5灰度值及陽性細胞個數較模型對照組增加(P<0.05)，較假手術組有所減少，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；用藥8周，治療組較模型對照組顯著增加(P<0.05)，較假手術組增加(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠脛骨上端軟骨下骨Smad-1/5灰度值及陽性細胞個數

注：與假手術組對比，▲P<0.05；與模型對照組對比，△P<0.05；與治療后4周對比：*P<0.05。

3 討論

膝骨關節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)，是一種以膝關節(jié)軟骨的變性、破壞及關節(jié)周圍骨質增生為特征的慢性關節(jié)病[1]，常見于中老年人，臨床上癥狀多表現為膝關節(jié)局部疼痛、晨僵、腫脹、活動受限，嚴重者可出現關節(jié)的畸形，并最終可導致殘疾的風險。中醫(yī)學認為該病當屬“膝痹”范疇，其病機為“本虛標實”，而腎虛血瘀則是發(fā)病的關鍵因素。本研究中，采用改良Hulth造模法復制膝骨性關節(jié)炎，即通過切除6月齡雌性老年大鼠的雙側膝關節(jié)前交叉韌帶、內側副韌帶及內側半月板，導致膝關節(jié)的持續(xù)力學失穩(wěn)態(tài)，進而誘發(fā)骨關節(jié)炎，有利于臨床與基礎研究相互結合而更加明確地闡述KOA的病理及作用機制。

骨吸收的增加和骨重建的加快為早期KOA關節(jié)軟骨下骨變化主要表現[4]，這種骨吸收增加可導致后期軟骨下骨骨質硬化和材料學性質改變，因此越來越多研究重視如何控制其軟骨下骨骨重建速度及改變軟骨下骨硬度。Felson等于1972年初次提出關節(jié)退變的發(fā)病機制可能起始于軟骨下骨[5]。骨組織持續(xù)不斷地重復著陳舊骨清除及新骨形成的骨重建過程，骨重建過程無論在細胞學還是組織學水平都被認為是骨吸收與骨形成過程的偶聯，一但發(fā)生失衡，即可導致骨量與骨結構的變化。在細胞水平，破骨細胞和成骨細胞的協(xié)同調控是骨重建中兩個最重要的過程[6]。在分子水平，多條骨重建調控途徑獲得證據被認為參與了KOA軟骨下骨骨重建的調控。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)途徑是主要參與調控骨形成過程的重要途徑之一。BMPs是一組多功能參與軟骨再生的主要軟骨形成生長因子，具有類似結構的高度保守的功能蛋白，在其羧基端部分包括特征性的7個高度保守的半胱氨酸，屬于轉化生長因子TGF-β超家族成員[7]。有研究[8]表明，TGF-β1和BMP2誘導的人關節(jié)軟骨細胞與骨關節(jié)炎關節(jié)軟骨細胞(AC)的淺表和深層亞群具有不同的代謝特征。BMP2不僅誘導軟骨形成，而且在異位骨/軟骨形成過程中促進軟骨內骨化，BMP2可以在同一系統(tǒng)內自發(fā)誘導軟骨形成分化，成骨分化和軟骨內骨形成，目前亦有相關研究用于軟骨組織工程以調節(jié)軟骨形成[9]。有研究[10-11]表明，細胞外信號調節(jié)激酶(ERKs)，c-Jun N-末端蛋白激酶(JNK)能通過介導的BMP2表達和Smad-1/5/8磷酸化增強成骨細胞分化。BMPs功能十分廣泛，其發(fā)揮生物學作用主要通過信號轉導蛋白 (drosophila mothers against decapentaplegic proteins，Smads)依賴性和非Smads 依賴性兩條途徑實現[12-13]。已有研究表明，抑制BMP2活性引起Smadl表達上調[14]；Runt相關轉錄因子2(runt-relatedtranscription factor 2，Runx2)可以與Smadl和Smad5相互作用而增強一些成骨細胞特異性基因的表達[15]；體內外研究已經確定BMP-Smad信號通路能調控成骨細胞生命周期的各個方面，包括骨髓間充質干細胞(MSCs)向成骨細胞分化、骨原細胞的擴增、成骨細胞礦化的活力以及其與破骨細胞的偶聯[16-17]。由此可知，骨吸收/骨形成偶聯發(fā)生失衡，即可導致骨量與骨結構的變化，可能與BMP-Smad信號通路的功能異常有關。Hyuck等[18]研究發(fā)現，通過刺激Smad-1/5/8和p38途徑增強BMP2的體內成骨能力，被認為是骨疾病的治療策略之一。

腎虛血瘀則是KOA發(fā)病的關鍵因素，補腎活血方作為我院的經驗方，具有補腎壯骨、健脾益氣、活血通絡的功效，在臨床治療KOA上取得一定的療效。前期基礎研究表明，補腎活血中藥治療KOA的療效和止痛效果均優(yōu)于塞來昔布,且在改善患者的膝關節(jié)功能和安全性方面與塞來昔布相當[19]；補腎活血方能抑制骨性關節(jié)炎關節(jié)軟骨中MMP-1 的表達及降低關節(jié)液中的PGE2水平，促進軟骨細胞生長，以減緩骨性關節(jié)炎[20]。本實驗結果表明，補腎活血方通過調控BMP-2及Smad-1/5在KOA大鼠軟骨下骨骨重建過程的表達水平，使BMP-2及Smad-1/5的表達水平提高；使軟骨下骨組織BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp水平重新調節(jié)以趨向平衡。經造模后的大鼠BV/TV、Tb.Th水平升高，這可能在OA早期階段，受到破壞的骨質，軟骨下骨破骨細胞的活躍，骨小梁破壞、吸收，然后啟動軟骨下骨的骨重塑過程，導致了軟骨下骨骨代謝增強，骨小梁的進一步增生和增厚。由此表明補腎活血方可能通過調控BMP-2及Smad-1/5水平，從而調控BMP-Smad信號通路使其骨吸收/骨形成偶聯趨向平衡。補腎活血方可以改善OA軟骨下骨異常代謝，從而起到預防和治療OA的作用。本研究為補腎活血方在防治OA上提供了一定的實驗依據。雖然目前中醫(yī)藥對OA作用機制有了一定深入的研究，也使得中醫(yī)藥治療骨關節(jié)炎的作用機制有一定的科學依據，對其的治病思路和用藥指導有一定的幫助，而且在越來越多的證據表明KOA與骨質疏松的發(fā)病及進展中相互聯系，而軟骨下骨在其中起著非常重要的作用，故科學研究不應只局限在關節(jié)軟骨方面，應多重視軟骨下骨的研究，其可能為治療KOA尋找新靶點提供的突破口，為補腎活血方治療KOA提供實驗依據和新的指導理論。