姜 濤，歐陽(yáng)文獻(xiàn)，譚艷芳，李雙杰

（湖南省兒童醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007）

手足口病主要由柯薩奇A組16型（CoxAl6）、腸道病毒7l型（enterovirus 71，EV71）［1］引起的急性出疹性傳染病，大部分患兒預(yù)后良好，少數(shù)病例可出現(xiàn)腦干腦炎、腦膜炎、腦脊髓炎、急性遲緩性癱瘓、肺水腫、循環(huán)障礙甚至死亡［2］。EV71型手足口病可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生多種復(fù)雜的免疫功能變化［3］，且EV71患兒更容易出現(xiàn)急性肺水腫和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，致死及致殘率相對(duì)更高［4］。研究表明，手足口病的發(fā)病與病毒直接侵犯細(xì)胞、HLA-A2宿主基因的易感性［5］、機(jī)體免疫功能的變化等有關(guān)［6］，而抗原提呈細(xì)胞處理抗原片段后激活NK細(xì)胞和Tc細(xì)胞，通過(guò)分泌顆粒酶穿孔素直接殺傷靶細(xì)胞［7］，在抗病毒中起著重要重要。故本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EV71型手口足病患兒體內(nèi)CD8＋T、NK細(xì)胞中穿孔素（perforin，PRF）和顆粒酶 B（granzyme B，GrzB）的變化，為探索EV71型手足口病發(fā)病機(jī)制提供新的依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2017年5—7月湖南省兒童醫(yī)院感染科住院治療的手足口病患兒60例，其中普通型手足口病患兒30例（普通型組），重型手足口病患兒30例（重型組），手足口病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照衛(wèi)生部制定的《手足口病預(yù)防控制指南（2010年版）》［8］，其診斷標(biāo)準(zhǔn)為：（1）輕型病例，手、足、口、臀部皮疹，伴或不伴發(fā)熱。（2）重癥病例，出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)，如精神差、嗜睡、易驚、譫妄、頭痛、嘔吐、肢體抖動(dòng)、肌陣攣、眼球震顫、共濟(jì)失調(diào)、眼球運(yùn)動(dòng)障礙，無(wú)力或急性弛緩性麻痹，驚厥，可見(jiàn)腦膜刺激征，腱反射減弱或消失。且EV71-IgM陽(yáng)性，排除其他肝炎病毒，EB病毒等感染。同時(shí)選擇本院體檢的健康志愿者30例作為健康對(duì)照組，年齡1～6歲，EV-71抗體陰性，無(wú)心、肝、腎、消化道病和神經(jīng)等系統(tǒng)疾病及代謝異常史。

1.2 倫理和知情同意 研究經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)審查并通過(guò)。所有研究對(duì)象在納入研究前，均獲得患兒監(jiān)護(hù)人同意，并簽署相關(guān)知情同意書。

1.3 材料與方法

1.3.1 主要試劑 PE／Cy 7 anti human CD56（Biolegend公司），Cytofix／CYTOPERM BUF KIT，CD3-PerCP熒光單克隆抗體試劑和CD8-FITC、hu perforin Alexa 647 Dta G9 和 hu Granzyme B PE MAB均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3.2 檢測(cè)方法 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PRF和GrzB表達(dá)水平：采集被研究者外周靜脈血2 mL，置于EDTA抗凝管中（12 h內(nèi)處理），采用人外周血淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMNC），加入以下表 面 抗 體 進(jìn) 行 染 色，anti-CD3-PerCP、anti-CD8-FITC、anti-CD56-APC（CD3＋CD8＋CTL 細(xì)胞、CD3-CD56＋NK細(xì)胞）。常規(guī)固定、破膜、洗滌后加人PE標(biāo)記的PRF或GrzB抗體，或其相應(yīng)的同型抗體，室溫下避光孵育1 h后洗滌，24 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司FACS CANTOII產(chǎn)品）進(jìn)行分析，以PRF或GrzB陽(yáng)性細(xì)胞率表示PRF或GrzB水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 應(yīng)用SPSS 18.0軟件處理數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（珚±s）表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD8＋T細(xì)胞PRF、GrzB的變化 與正常對(duì)照組相比，普通型組和重型組EV71手足口病患兒急性期CD8＋T細(xì)胞PRF、GrzB的表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。普通型組和重型組EV71手足口病恢復(fù)期患兒CD8＋T細(xì)胞PRF、GrzB的表達(dá)水平較急性期明顯下降，但仍高于正常組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 普通型組和重型組EV71型手口足病患兒體內(nèi)CD8＋T細(xì)胞PRF、GrzB的變化Table 1 Changes in PRF and GrzB in CD8＋ T cells in children with common and severe EV71 HFMD

2.2 NK細(xì)胞PRF、GrzB的變化 與正常對(duì)照組相比，普通型組和重型組EV71手足口病患兒急性期NK細(xì)胞PRF、GrzB的表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。EV71手足口病患兒急性期NK細(xì)胞PRF、GrzB的表達(dá)水平：普通型組和重型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。普通型組EV71手足口病恢復(fù)期患兒NK細(xì)胞中PRF、GrzB的表達(dá)水平較急性期雖稍升高，但差異仍無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。重型組EV71手足口病恢復(fù)期患兒NK細(xì)胞中PRF、GrzB的表達(dá)水平較急性期明顯升高（均P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 普通型組和重型組EV71型手口足病患兒體內(nèi)NK細(xì)胞PRF、GrzB的變化Table 2 Changes in PRF and GrzB in NK cells in children with common and severe EV71 HFMD

3 討論

EV71是一種新型腸道病毒，自1969年首次被分離鑒定后，1973年才被認(rèn)為與手足口病相關(guān)。EV71引起的手口足病以重型多見(jiàn)，3歲男性患兒為主［9］，夏秋季節(jié)好發(fā)［10］。近幾十年來(lái)，EV71在全球連續(xù)暴發(fā)，威脅到兒童的健康和生命［11］。

EV71感染后可致機(jī)體極其復(fù)雜的免疫功能變化，出現(xiàn)固有、細(xì)胞和體液免疫功能紊亂，與疾病的進(jìn)展及嚴(yán)重程度有關(guān)。而機(jī)體對(duì)病毒的有效識(shí)別和清除依賴于天然免疫和獲得性免疫的相互補(bǔ)充和協(xié)作，作為固有免疫的主要細(xì)胞NK細(xì)胞，是機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的第一道防線。研究［12］表明，EV71感染導(dǎo)致外周血NK細(xì)胞數(shù)目顯著減少，功能減弱甚至缺陷，從而加快病程的發(fā)展。另外，細(xì)胞免疫在抗病毒中亦起到關(guān)鍵作用。EV7l感染后，缺乏CD4＋或CD8＋T細(xì)胞的小鼠發(fā)生了更嚴(yán)重的疾病［13］。與正常對(duì)照組相比，手足口病患兒總T細(xì)胞、CD4＋T細(xì)胞數(shù)量減少，CD4＋／CD8＋比值降低，表明EV71感染導(dǎo)致患兒細(xì)胞免疫功能紊亂，重癥病例尤為明顯［3，14－15］。由此可見(jiàn)，CD8＋T 細(xì)胞和 NK 細(xì)胞在機(jī)體抗EV71中起著重要作用。

CD8＋T細(xì)胞和NK細(xì)胞中有兩個(gè)主要的細(xì)胞殺傷機(jī)制，一個(gè)是Th細(xì)胞表明抗原Fas配體L（Fas L）和Fas靶細(xì)胞表面抗原的相互作用［16］。另一個(gè)是顆粒胞外分泌通路，PRF以及其他介質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)后，與靶細(xì)胞膜結(jié)合，并嵌入膜內(nèi)，形成一個(gè)中空的多聚體，導(dǎo)致膜的完整性受損，水分子、離子以及其他的小分子進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)滲透壓改變而造成細(xì)胞死亡［17］。顆粒酶在PRF協(xié)同作用下通過(guò)顆粒胞吐作用（granule exocytosis）釋放進(jìn)入靶細(xì)胞之間形成的免疫突觸中，然后進(jìn)入靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，并在細(xì)胞核聚集，誘導(dǎo)一種叫天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（caspases）的非依賴性細(xì)胞死亡，迅速清除細(xì)胞內(nèi)的病原體和有病變的細(xì)胞［18］。研究表明，PFN基因敲除小鼠感染流感病毒A后，肺內(nèi)病毒大量繁殖，病毒清除時(shí)間延長(zhǎng)，NK和CTL殺傷活性顯著降低，提示PFN在控制流感病毒感染中起著重要作用［19］，PRF表達(dá)的不足，與HBV感染慢性化［19］和 HIV［20］感染相關(guān)。由此可見(jiàn)，PRF及GrzB介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷及細(xì)胞毒性作用在病毒感染等疾病中起著重要作用。而目前尚未見(jiàn)PRF及GrzB在EV71手足口病中作用的研究。

本研究中，60例手足口病患兒，經(jīng)積極抗病毒和對(duì)癥支持等治療后，均痊愈出院。普通型和重型手足口病患兒體內(nèi)CD8＋T和NK細(xì)胞中PRF、GrzB的水平明顯升高，機(jī)體抗病毒作用的增強(qiáng)，有利于病情恢復(fù)，而重型手足口病患兒體內(nèi)CD8＋T細(xì)胞PRF及GrzB有所升高，但低于普通型手足口病患兒，由于機(jī)體抵抗病毒能力不足，導(dǎo)致病毒大量復(fù)制及擴(kuò)散，免疫細(xì)胞持續(xù)活化，大量炎癥因子釋放，加重機(jī)體組織損傷，從而導(dǎo)致患兒病情加重。隨著患兒病情恢復(fù)，普通型和重型手足口病患兒體內(nèi)，CD8＋T細(xì)胞中PRF及GrzB的水平有所下降，但仍高于正常組；NK細(xì)胞中PRF、GrzB：重型組恢復(fù)期較急性期明顯升高，而在普通對(duì)照組中無(wú)差異，由此可見(jiàn)，CD8＋T和NK細(xì)胞在機(jī)體恢復(fù)期起到持續(xù)抗病毒作用，有助于病情的恢復(fù)，尤其是NK細(xì)胞PRF、GrzB水平的升高，在重型手足口病患兒恢復(fù)期中起著重要作用。

綜上所述，EV71手足口病患兒體內(nèi)免疫功能紊亂，重型EV71手足口病患兒的免疫功能紊亂更加明顯，早期檢測(cè)CD8＋T細(xì)胞中PRF、GrzB水平，或許可作為判斷疾病嚴(yán)重程度的臨床指標(biāo)。本課題由于時(shí)間及客觀因素并未收集到危重型手足口病病例，無(wú)法全面了解其在EV71手足口病中的作用，有待于進(jìn)一步研究。