劉 靈,白 麗,段瑞嫻

(山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,山西 太原030000)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)本質(zhì)是氣道慢性炎癥。白介素-10(IL-10)是一種抑制性細(xì)胞因子,能夠抑制氣道中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子,促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡,清除肺部炎癥[1]。除了肺部的慢性炎癥、蛋白酶失衡等在COPD發(fā)病中起重要作用外,細(xì)胞凋亡在COPD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中也是應(yīng)當(dāng)重視的作用機(jī)制[2]。體外培育牛黃的性狀、成分、藥效與天然牛黃一致,具有抗炎、抗氧化、清除自由基、提高免疫力等作用[3]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)體外培育牛黃治療COPD的研究較少,本研究采用ELISA法測(cè)定大鼠血清IL-10的含量,通過(guò)TUNEL技術(shù)檢測(cè)Ⅱ型肺泡細(xì)胞的凋亡,了解體外培育牛黃對(duì)COPD的保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 分組及模型制備 將體質(zhì)量(200±30)g清潔級(jí)健康雄性8周齡Wistar大鼠50只(購(gòu)于山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號(hào):晉SCXK 2015-0001)適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組(A組),COPD模型組(B組)、牛黃干預(yù)組(C組)、布地奈德(激素)干預(yù)組(D組)、牛黃+激素干預(yù)組(E組),各組動(dòng)物的飼養(yǎng)條件相同。B、C、D、E組制備COPD模型[4]。制備2 mg/mL脂多糖溶液[10 mg脂多糖(北京索萊寶科技有限公司)溶解于5 mL 0.9%氯化鈉注射液中],分別于第1、15日注入B、C、D、E組大鼠氣道內(nèi),被動(dòng)吸煙(每日2次,每次間隔2 h,每次點(diǎn)燃12支香煙)。A組:第1、15日在大鼠氣道內(nèi)注入0.1 mL 0.9%氯化鈉注射液。C組:在每次煙熏前1 h給予體外培育牛黃(武漢健民大鵬藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字Z20030011)灌胃(將1.5 g體外培育牛黃溶解于6 mL蒸餾水中,配成濃度為250 mg/mL溶液)。D組:在每次煙熏前1 h給予霧化吸入布地奈德(AstraZeneca Pty Lt d)1 mg/d。E組:在每次煙熏前1 h給予體外培育牛黃灌胃(800 mg/kg)和霧化吸入布地奈德1 mg/d。4周后用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠。

1.2 標(biāo)本采集及制備

(1)將成功麻醉的大鼠固定于解剖臺(tái)上,打開胸腔,心臟取血5 mL,離心分離血清,置于-20℃冰箱中保存。采用ELISA法測(cè)定血清中IL-10含量,試劑盒購(gòu)置于武漢博士德生物。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作。

(2)取右肺上葉約1.0 c m×1.0 c m×0.2 c m標(biāo)本,用0.9%氯化鈉注射液沖洗干凈,置于中性甲醛液中固定24 h,常規(guī)石蠟包埋,應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡。

1.3 TUNEL法檢測(cè) 試劑盒購(gòu)置于武漢博士德生物。①嚴(yán)格按照說(shuō)明書完成實(shí)驗(yàn)步驟。②結(jié)果判定:鏡下細(xì)胞核中為棕黃色顆粒的即為凋亡細(xì)胞。在400倍光鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野,再隨機(jī)觀察100個(gè)Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞,凋亡細(xì)胞數(shù)目/100表示凋亡指數(shù),再計(jì)算平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,多組資料進(jìn)行方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 A組大鼠活潑好動(dòng),食量正常;呼吸平穩(wěn),呼吸道無(wú)分泌物,未聞及痰鳴音。B、C、D、E組大鼠逐漸出現(xiàn)蜷伏少動(dòng),撮毛,食量減少,毛發(fā)黃、易脫落,體重較A組減輕;呼吸急促,呼吸道有分泌物從口鼻流出,偶可聞及咳嗽及氣道痰鳴音,隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),上述癥狀逐漸加重。

2.2 大鼠肺組織病理切片觀察 A組:肺泡結(jié)構(gòu)正常。B組:可見支氣管纖毛部分脫落,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡腔擴(kuò)大,肺大泡。C組:局部肺泡擴(kuò)張、融合,可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),但肺泡融合程度、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡間隔斷裂等方面較B組減輕。D組:局部肺泡擴(kuò)張、融合,可見少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),但是肺泡融合程度、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肺泡間隔斷裂等方面較B組減輕。E組:少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡間隔斷裂及肺大泡的形成比B、C、D組大鼠明顯減輕(圖1見本期第117頁(yè))。

2.3 IL-10檢測(cè)結(jié)果 與A組比較,其他各組大鼠的IL-10含量增高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);5組大鼠IL-10含量多重比較,除C組和D組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P＞0.05),其余各組比較組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組COPD大鼠血清IL-10含量比較

2.4 TUNEL測(cè)定Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)TUNEL染色顯示細(xì)胞核內(nèi)含有棕黃色顆粒者為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(圖2見本期第117頁(yè))。與A組比較,B、C、D、E組大鼠的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);5組大鼠的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)多重比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組COPD大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

表2 各組COPD大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

注:與A組比較,▲P＜0.05;與B組比較,◇P＜0.05;與C組比較,★P＜0.05;E組與D組比較,△P＜0.05

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3 討論

COPD患者IL-10含量降低及其調(diào)控分泌的促炎癥細(xì)胞因子的增加可能是氣道持續(xù)炎癥并導(dǎo)致氣道重塑、氣流受限、肺組織破壞等病理過(guò)程的重要機(jī)制[5]。而以肺結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡為特征的肺氣腫改變是導(dǎo)致患者肺殘氣量增加、肺順應(yīng)性下降等肺功能減退的主要病理基礎(chǔ)[6]。TUNEL法對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色,能準(zhǔn)確反映細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征[7]。體外培育牛黃是在仿生學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上模仿牛膽內(nèi)的生物環(huán)境研制而成,體外培育牛黃對(duì)急性炎癥的滲出和慢性炎癥的增生及結(jié)構(gòu)細(xì)胞凋亡均有顯著的抑制作用,還能提高機(jī)體耐缺氧能力,所以推測(cè)體外培育牛黃可能對(duì)COPD也具有保護(hù)作用[8-9]。

吸煙和感染是引起COPD發(fā)病最主要的環(huán)境因素。筆者對(duì)大鼠進(jìn)行煙霧刺激并注射脂多糖誘發(fā)感染以模擬其病理生理過(guò)程,4周后模型組病理改變結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致,符合COPD病理的特征性表現(xiàn)。本研究結(jié)果中5組大鼠血清中IL-10含量多重比較,除C組和D組相互比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P＞0.05),其余各組比較組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),提示體外培育牛黃可以降低COPD的炎癥反應(yīng)并減輕肺組織的病理?yè)p害。本研究結(jié)果表明,COPD的發(fā)病與肺泡上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡密切相關(guān),而組間比較提示體外培育牛黃可以降低COPD模型大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞凋亡,與霧化激素聯(lián)合作用更明顯。但體外培育牛黃對(duì)COPD的保護(hù)作用的量效關(guān)系尚需進(jìn)一步研究探討。