宋志勇 穆亞敏*

（湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭 411102）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種常見于老年人的神經(jīng)退行性疾病，隨著社會(huì)老齡化進(jìn)程的加快，AD的發(fā)病率正不斷增高。目前AD的治療尚無特效藥物，故預(yù)防和尋找AD發(fā)病的早期生物學(xué)標(biāo)志物就成為了人們研究的熱點(diǎn)。研究表明：AD的發(fā)病與人體血脂代謝密切相關(guān)，ApoE通過脂類代謝進(jìn)而影響到阿爾茨海默病的病理過程[1]，載脂蛋白E（ApoE）由299個(gè)氨基酸組成，是極低密度脂蛋白、乳糜微粒和高密度脂蛋白的組成成分，也是外周組織中低密度脂蛋白受體的主要配體。在血液中，膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）轉(zhuǎn)運(yùn)到外周組織的過程中，ApoE起著重要的作用[2]。人類ApoE基因位于19號(hào)染色體長臂13區(qū)2帶（19q13.2）上，它有3個(gè)等位基因ε2，ε3，ε4，其中，ε4等位基因被認(rèn)為是遲發(fā)型阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)基因。本研究觀察湘潭社區(qū)中老年人血清三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）以及極低密度脂蛋白（VLDL-C）與ApoE基因型之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2018年春季體檢的湘潭社區(qū)60周歲以上（含60周歲）的老年漢族人群，選取排除高血壓、糖尿病，并在湘潭居住超過20年的老年人102例，年齡分布為60～85周歲，其中男性30例，女性72例。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA模板和測(cè)定血清生化值：志愿者于清晨空腹抽取外周靜脈血4 mL（3 mL用于基因DNA模板提取，1 mL用于檢測(cè)血清TG、TC及HDL-C、LDL-C、VDLD-C水平），將3 mL靜脈血加入經(jīng)EADT抗凝處理的試管，再往試管中加入1.5 mL濃度為4%的葡聚糖溶液，采用葡聚糖沉淀法從全血白細(xì)胞中提取DNA，通過酚氯仿法抽提模板DNA。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定DNA基因組純度和濃度，通過測(cè)定OD260和OD280的吸光比值計(jì)算DNA的濃度，經(jīng)純度檢測(cè)模板DNA濃度在30～50 ng/μL，符合目標(biāo)基因擴(kuò)增要求。將提取到的DNA模板置于負(fù)20 ℃冰箱中保存待用。1 mL的靜脈血注入到未經(jīng)抗凝處理的試管中，待血液凝固后抽提血清進(jìn)行相關(guān)生化指標(biāo)測(cè)定。血清TG、TC、LDL-C、HDL-C，VLDL-C水平全部由湘潭市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科用全自動(dòng)生化儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR-RLFP）技術(shù)檢測(cè)DNA基因多態(tài)性：應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行ApoE基因擴(kuò)增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，上游引物: 5'-ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC AC-3'；下游引物: 5'-TAA GCT TGG CAC GGC TGT CCA AGG A-3'。PCR反應(yīng)體系：DNA模板4 μL（200ng左右），10×buffer 3 μL，上下游引物各2 μL，2mM dNTPs 0.5 μL，MgCl2溶液2.5 μL，5 U/μL Taq酶0.5 μL，三蒸水10.5 μL，總體積為25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，33個(gè)循環(huán)（95 ℃ 30 s，69 ℃ 1 min，72 ℃ 50 s），72 ℃延伸7 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物鑒定：1.5%瓊脂糖凝膠電泳（1×TAE buffer配膠，EB染色），75V電壓電泳45 min，凝膠成像儀系統(tǒng)觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。應(yīng)用限制性內(nèi)切酶HhaI酶解PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。酶切體系：10×buffer 2 μL，三蒸水5.5 μL，BSA 2 μL，HhaI（5 U/μL） 0.5 μL，ApoE擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL，共計(jì)20 μL，置于37 ℃水浴箱中酶切消化過夜（12 h以上）。抽取酶切后產(chǎn)物10 μL，進(jìn)行4%瓊脂糖凝膠電泳（0.5×TBE buffer配膠，EB染色），開始50 V電壓加樣，待膠孔加樣后75 V電壓電泳3 h，取出在凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

圖1 APOE基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 APOE基因分型

表1 APOE基因型之間TG、TC、HDL-C、LDL-C、VLDL-C濃度的比較（M（QR），mmol/L）

表2 APOE等位基因之間TG、TC、HDL-C、LDL-C、VLDL-C濃度的比較（M（QR），mmol/L）

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：運(yùn)用χ2檢驗(yàn)ApoE基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡，使用SPSS19.0和SAS V8數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)方法對(duì)ApoE各基因型和等位基因與血清TG、TC、HDL-C、LDL-C以及VLDL-C水平之間指標(biāo)進(jìn)行比較，對(duì)有差別的組間再運(yùn)用Nemenyi檢驗(yàn)兩兩比較，P＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ApoE基因PCR擴(kuò)增及酶切產(chǎn)物：DNA模板PCR擴(kuò)增結(jié)果，凝膠成像儀系統(tǒng)觀察顯示擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度為：244bp（圖1），全部DNA基因標(biāo)本經(jīng)PCR-RLFP技術(shù)處理后目標(biāo)基因ApoE酶切后分型，可見四種基因型，分別是：ε2/ε3基因型可見91bp，83bp，48bp，35bp四條帶；ε2/ε4基因型可見91bp，83bp，72bp，48bp，35bp五條帶；ε3/ε3基因型可見91bp，48bp，35bp三條帶；ε3/ε4基因型可見91bp，72bp，48bp，35bp四條帶（圖2），而ε2/ε2和ε4/ε4兩種基因型未見。各基因型的分布為：ε2/ε320例，ε2/ε41例，ε3/ε376例，ε3/ε45例。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，ApoE各基因型實(shí)測(cè)值與期望值相比未見顯著性差異（P值＞0.05），符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.2 ApoE各基因型及等位基因間血脂各指標(biāo)水平的比較：比較ApoE基因ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4四種基因型之間的生化各指標(biāo)之間的差異性，男性組與女性組之間各指標(biāo)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；全性別、ApoE各基因型之間的血脂各指標(biāo)水平運(yùn)用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)：TC、LDL-C水平在各基因型之間有差別，P值分別為0.043和0.028，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1），運(yùn)用Nemenyi檢驗(yàn)對(duì)有差異組間進(jìn)行兩兩比較：ε3/ε4基因型的TC、LDL-C水平高于ε2/ε3基因型（P值分別為0.048和0.029）；ApoE各等位基因之間的血脂各指標(biāo)水平Kruskal-WallisH檢驗(yàn)：TC、LDL-C水平在各等位基因型之間有差別，P值分別為0.022和0.032，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2），運(yùn)用Nemenyi檢驗(yàn)對(duì)有差異組間進(jìn)行兩兩比較：ε4等位基因攜帶者的TC、LDL-C水平高于ε2等位基因攜帶者（P值分別為0.043和0.025）。

3 討 論

目前，國內(nèi)有研究表明ApoE基因多態(tài)性與血脂的代謝有著密切的聯(lián)系，ApoE基因中攜帶ε4等位基因者的TC和HDL-C水平相對(duì)較高，而攜帶ε2等位基因者的TG水平相對(duì)較低[3]。ApoE基因中ε4與TC、LDL-C水平呈負(fù)相關(guān)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)攜帶ε4等位基因者比攜帶ε2者的TC、LDL-C水平較高，但TG水平在ε2、ε3、ε4各等位基因攜帶者中未見明顯差異，這可能與老年人的日常膳食，對(duì)富含油脂食物的喜好不同進(jìn)而影響到TG水平有關(guān)，同時(shí)，ApoE基因中ε4等位基因攜帶者具有相對(duì)較高的膽固醇水平是否與環(huán)境因素、血脂代謝及其他有關(guān)基因等相關(guān)有待進(jìn)一步研究。