朱智勇，靳衛(wèi)權(quán)，王銀星，趙 振，馬穎才，王亞平

(青海省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，西寧810007)

高原心臟病是由急慢性低氧累及心臟所引起的一種特殊類(lèi)型的心臟病，通常發(fā)生在海拔3 000 m以上。由于低氧性肺動(dòng)脈高壓，使右心負(fù)荷加重、右心功能障礙，進(jìn)一步使心肌收縮力減弱，心輸出量降低，嚴(yán)重可致右心衰竭［1］。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于高原心臟病的防治研究逐漸增多，但均未形成統(tǒng)一共識(shí)，高原心臟病的發(fā)病率及死亡率仍較高。大量的研究證實(shí)，缺氧通過(guò)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，造成心肌細(xì)胞數(shù)量減少，是高原心臟病的主要發(fā)病原因［2］。但缺氧致心肌細(xì)胞凋亡損傷的相關(guān)機(jī)制不明。

自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞中的、進(jìn)化上高度保守的一種通過(guò)降解和循環(huán)利用基質(zhì)來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的溶酶體依賴性降解過(guò)程，在低氧、病原微生物入侵、缺血/再灌注等各種因素刺激下，細(xì)胞自噬活性顯著升高［3－4］。研究發(fā)現(xiàn)自噬與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［5－6］，但心肌細(xì)胞自噬在心肌急慢性缺氧以及壓力負(fù)荷過(guò)重等各種應(yīng)激情況下的變化情況以及功能還不清楚，且缺乏急慢性低氧環(huán)境下的系統(tǒng)性觀察研究。

因此，本研究通過(guò)檢測(cè)大鼠心肌組織細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin－1、LC3－Ⅱ的表達(dá)水平，觀察其在不同低氧時(shí)間下的變化趨勢(shì)，揭示自噬在低氧性心肌細(xì)胞凋亡損傷中的作用及其機(jī)制，以期為高原心臟病發(fā)病機(jī)制的深入研究及新藥的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組方法

選取6～8周齡的成年雄性Wistar大鼠60只(由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):0003127)，由西安空運(yùn)至西寧，隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10，西寧，2260米)與實(shí)驗(yàn)組(n=50，低壓氧艙，5000米)，實(shí)驗(yàn)組大鼠迅速置于低壓氧艙(模擬海拔5000米)，建立大鼠高原低氧環(huán)境暴露模型，根據(jù)低氧暴露時(shí)間不同，分為低氧 1、7、14、21、28 d 組，每組各10只，分別取各組大鼠右心室心肌組織，其中對(duì)照組在西寧取材，實(shí)驗(yàn)組在低壓氧艙取材。

1.2 主要儀器及試劑

低壓氧艙室(貴州風(fēng)雷航空機(jī)械有限公司，型號(hào):DYC－3000，體積:8m×3m×3m)，正置顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)，石蠟切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司)，大鼠Beclin－1多克隆抗體(博士德生物有限公司，免疫組織化學(xué)檢測(cè)工作濃度為1:200)，LC3－II多克隆抗體(美國(guó)Abcam有限公司，免疫組織化學(xué)檢測(cè)工作濃度為1:200)。TRIzol RNA提取試劑盒(美國(guó)ambion公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TAKARA公司)，SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(美國(guó)KAPA Biosystems公司)。目的基因Beclin－1、LC3－Ⅱ及內(nèi)參基因β－actin引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 大鼠心肌組織大體形態(tài)

按不同時(shí)間點(diǎn)用25%烏拉坦行腹腔注射麻醉，開(kāi)胸取各組大鼠右心室心肌組織，用生理鹽水清洗干凈，并將組織剪切為多個(gè)大小相近的小塊，將一小塊心肌組織固定于4%多聚甲醛溶液中，以各級(jí)酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，并脫蠟，切片入蘇木素中染色約10～30 min，分色，然后用0.5%伊紅酒精液復(fù)染，HE染色結(jié)束后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠心肌組織大體形態(tài)結(jié)構(gòu)改變及組織細(xì)胞凋亡壞死情況，分析比較各組之間變化差異。

1.4 大鼠心肌組織Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白表達(dá)水平

通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠心肌組織Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白表達(dá)水平。依次將石蠟切片進(jìn)行烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷，然后滴加一抗，濕盒孵育，室溫下放置1 h，用PBS沖洗，滴加maxvision二抗，濕盒孵育，室溫下放置20～30 min，用PBS沖洗、DAB染色，觀察到切片有顏色改變時(shí)，用自來(lái)水洗去染色液、蘇木素復(fù)染、1%鹽酸酒精分化，顯微鏡下觀察，控制染色程度，用自來(lái)水沖洗，放入65℃烘箱中烘干水分，將玻片置于二甲苯中透明，中性樹(shù)膠封片，放入65℃烘箱中15 min，最后通過(guò)顯微鏡拍照、Lecia Applaction Stiue圖像系統(tǒng)采集分析樣本相關(guān)部位，免疫組織化學(xué)染色所得圖像采用Image－pro plus 6.0軟件，使用平均光密度值(IDO)進(jìn)行半定量分析。

1.5 大鼠心肌組織 Beclin－1、LC3－Ⅱ的 mRNA 表達(dá)水平

使用TRIzol RNA提取試劑盒提取大鼠心肌組織細(xì)胞總RNA，測(cè)定其濃度及質(zhì)量，取2μg A260/A280為1.9～2.0的總RNA為逆轉(zhuǎn)錄模板，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA用于real－time PCR實(shí)驗(yàn)。

采用Real－time PCR法檢測(cè)大鼠心肌組織細(xì)胞Beclin－1及LC3－ⅠI的mRNA表達(dá)水平。引物序列如下，目的基因:LC3－ⅠI－rat f5'－AAGCACTACGGCTGCTCTTT－3'，LC3－ⅠI－rat r5'－CCCATTGCTGGAGTGCTGTA－3';Beclin－1－rat f5'－CACTCTGATCGGGGAGGCAT－3'，Beclin－1－rat r5'－TCCAACATCTCCAAACAGCGT－3';內(nèi)參基因:β－actin－rat f5'－GGGGCTCTCTGCTCCTCCCTG－3'，β－actin－rat r5'－CCAGGCGTCCGATACGGCCA－3'。

PCR反應(yīng)體系(20μL體系):2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，第一鏈 cDNA 1 μL，目的基因Beclin－1及LC3－ⅠI及內(nèi)參基因 β－actin上、下游引物各5 mol(0.5μL)，用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至 20 μL。實(shí)驗(yàn)在ABI7500熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行。目的基因與內(nèi)參基因的PCR反應(yīng)條件一致，95℃，3 min;95℃，5 sec;56 ℃，10 sec;72 ℃，25 sec，39 個(gè)循環(huán)，繪制熔解曲線，使用SYBR Green檢測(cè)熒光改變，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)獲取的循環(huán)閾值(CT值)，采用相對(duì)定量法計(jì)算2－△△CT，分析數(shù)據(jù)，比較組間差異。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用珋x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織大體形態(tài)改變情況

用低壓氧艙模擬5 000 m高海拔(嚴(yán)重低氧環(huán)境)構(gòu)建大鼠心肌組織細(xì)胞損傷模型，各組大鼠心肌組織行HE染色。顯微鏡觀察結(jié)果:對(duì)照組心肌結(jié)構(gòu)正常，心肌細(xì)胞平行排列，核位于中央，胞內(nèi)可見(jiàn)清楚的橫紋;低氧1 d組肌纖維排列規(guī)則，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，少量肌細(xì)胞細(xì)胞核固縮凋亡，余未見(jiàn)明顯異常;低氧7 d組肌纖維排列紊亂疏松，大量肌纖維束斷裂，肌細(xì)胞邊界不清，大量肌細(xì)胞變性壞死;低氧14 d組肌纖維排列紊亂疏松，大量肌纖維束斷裂，局灶可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，大量肌細(xì)胞凋亡壞死;低氧21 d組肌纖維排列紊亂疏松，大量肌纖維束斷裂，局灶出現(xiàn)淤血，大量肌細(xì)胞凋亡壞死;低氧28 d組肌纖維排列紊亂疏松，大量肌纖維束斷裂，少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，局灶可見(jiàn)淤血，大量肌細(xì)胞凋亡壞死。HE染色顯示隨著低氧暴露時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，心肌組織細(xì)胞凋亡損傷逐漸加重(圖1)。

圖1 大鼠心肌組織HE染色圖Figure 1 HE staining of myocardial tissue in rats

2.2 各組大鼠心肌組織Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白表達(dá)水平

采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)各組大鼠心肌組織細(xì)胞Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白表達(dá)水平，使用IDO進(jìn)行半定量分析。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，低氧1、7、14、21、28 d 組大鼠心肌組織 Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白表達(dá)水平均明顯增加，并且隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加(均 P＜0.05)(圖 2～3，表 1)。

圖2 大鼠心肌組織Beclin－1免疫組化圖Figure 2 Immunohistochemical results of Beclin－1 in myocardial tissue inrats

圖3 大鼠心肌組織LC3－Ⅱ免疫組化圖Figure 3 Immunohistochemical results of LC3－Ⅱin myocardial tissue in rats

表1 各組大鼠心肌組織Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白表達(dá)水平(±s)Table 1 Protein expressions of Beclin－1 and LC3－Ⅱin myocardial tissue in rats(±s)

表1 各組大鼠心肌組織Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白表達(dá)水平(±s)Table 1 Protein expressions of Beclin－1 and LC3－Ⅱin myocardial tissue in rats(±s)

*:與對(duì)照組比較，P＜0.05;△:與低氧 1 d 組比較，P＜0.05;#:與低氧7 d 組比較，P＜0.05;$:與低氧14 d 組比較，P＜0.05;＆:與低氧 21 d 組比較，P＜0.05.

組別 例數(shù)(n) Beclin－1 LC3－Ⅱ?qū)φ战M 10 6913.09±772.05 3327.75±159.93低氧 1 d 10 9682.77±1742.41* 5288.94±853.48*低氧 7 d 10 14895.71±1422.17＊△ 8458.87±253.80＊△低氧 14 d 10 25277.73±2721.79＊△# 16248.86±901.55＊△#低氧 21 d 10 35169.90±1539.75＊△#$ 26055.75±742.34＊△#$低氧 28 d 10 42569.15±1289.34＊△#$＆ 30055.46±2413.24＊△#$＆F 290.88 373.96 P 0.000 0.000

2.3 各組大鼠心肌組織Beclin－1、LC3－Ⅱ的mRNA表達(dá)水平

采用Real－time PCR法檢測(cè)各組大鼠心肌組織Beclin－1、LC3－Ⅱ的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示:低氧各組大鼠心肌組織Beclin－1、LC3－Ⅱ的mRNA表達(dá)變化與蛋白表達(dá)基本一致，與對(duì)照組相比，低氧1、7、14、21、28 d 組大鼠心肌組織 Beclin－1、LC3－Ⅱ的mRNA表達(dá)水平均明顯增加，并且隨著低氧時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加(均P＜0.05)(表2)。

表2 各組大鼠心肌組織Beclin－1、LC3－Ⅱ的mRNA表達(dá)水平(±s)Table 2 mRNA levels of Beclin－1 and LC3－Ⅱin myocardial tissue in rats(±s)

表2 各組大鼠心肌組織Beclin－1、LC3－Ⅱ的mRNA表達(dá)水平(±s)Table 2 mRNA levels of Beclin－1 and LC3－Ⅱin myocardial tissue in rats(±s)

*:與對(duì)照組比較，P＜0.05;△:與低氧 1 d 組比較，P＜0.05;#:與低氧7 d 組比較，P＜0.05;$:與低氧14 d 組比較，P＜0.05;＆:與低氧 21 d 組比較，P＜0.05.

組別 例數(shù)(n) Beclin－1 LC3－Ⅱ?qū)φ战M 10 1.59±0.22 1.05±0.35低氧 1 d 10 3.54±0.54*3.29±1.03*低氧 7 d 10 5.25±1.02＊△ 5.88±1.87＊△低氧 14 d 10 6.99±1.76＊△# 8.14±2.23＊△#低氧 21 d 10 8.68±2.19＊△#$ 10.42±3.08＊△#$低氧 28 d 10 10.34±3.05＊△#$＆ 12.71±3.85＊△#$＆F 34.26 33.91 P 0.000 0.000

3 討論

本研究通過(guò)HE染色觀察了不同低氧時(shí)間下大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡損傷的變化，并分別檢測(cè)了各組大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白Beclin－1、LC3－Ⅱ的蛋白及mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，隨著低氧暴露時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡壞死數(shù)量逐漸增加，損傷程度逐漸加重，心肌組織中Beclin－1、LC3－Ⅱ的表達(dá)水平逐漸升高。國(guó)外離體細(xì)胞培養(yǎng)研究顯示，隨著缺氧刺激條件的持續(xù)存在，心肌細(xì)胞自噬增強(qiáng)導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡損傷，心功能降低［7］，本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果基本一致。

已知生理狀況下自噬一般保持較低水平，在一些應(yīng)激刺激因素作用下，組織細(xì)胞自噬活性可大大增加，發(fā)揮一定的保護(hù)作用［8，9］，但同時(shí)自噬程度過(guò)低或過(guò)度都是有害的，過(guò)多的自噬可加重組織細(xì)胞凋亡壞死，破壞組織器官正常功能的發(fā)揮［10］。低氧作為應(yīng)激因素誘導(dǎo)機(jī)體組織細(xì)胞發(fā)生自噬變化，不同類(lèi)型的細(xì)胞自噬對(duì)缺氧的反應(yīng)不同，自噬可以誘導(dǎo)細(xì)胞存活，也可以誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡，相關(guān)報(bào)道認(rèn)為輕度低氧下自噬促進(jìn)細(xì)胞存活，而嚴(yán)重低氧下自噬能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡損傷［11］。研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注階段自噬水平增加可損傷心肌細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而干擾或抑制自噬相關(guān)基因Beclin－1的表達(dá)可以減少缺血再灌注后心肌細(xì)胞損傷［12］;嚴(yán)重缺血缺氧時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞可通過(guò)激活自噬而加重腦損傷，嚴(yán)重影響腦神經(jīng)功能［13］;給予自噬誘導(dǎo)劑可加重急性壞死性胰腺炎大鼠胰腺組織細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)［14］;抑制自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)可降低缺血再灌注腎小管上皮細(xì)胞的壞死程度［15］，抑制自噬也減少了同種異體腎移植缺血再灌注后凋亡壞死的腎小管上皮細(xì)胞數(shù)量［16］。這些均表明，持續(xù)嚴(yán)重的低氧可誘導(dǎo)自噬介導(dǎo)的組織細(xì)胞凋亡損傷。心肌細(xì)胞作為一種長(zhǎng)壽命高度分化終末細(xì)胞，其分化再生能力非常有限，心肌細(xì)胞自噬在心肌缺血、缺氧以及壓力負(fù)荷過(guò)重等各種應(yīng)激下增強(qiáng)，但其在這些疾病下的具體作用還不清楚，總體認(rèn)為在心臟疾病的發(fā)生發(fā)展中，細(xì)胞自噬的作用具有雙重性，低水平的自噬能降解受損的細(xì)胞器，供給氨基酸和游離脂肪酸，進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞免于死亡［17，18］，但持久過(guò)度的自噬則會(huì)過(guò)度消耗必須蛋白質(zhì)和正常細(xì)胞器，不利于細(xì)胞生存［19，20］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠暴露在 5 000 m 嚴(yán)重低氧環(huán)境下，隨著低氧時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，心肌組織自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平逐漸增加，而細(xì)胞凋亡損傷卻逐漸加重，認(rèn)為在嚴(yán)重低氧環(huán)境下，心肌組織細(xì)胞可通過(guò)增加自噬水平而加重細(xì)胞凋亡損傷，最終致心功能下降，促進(jìn)高原性心臟病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究結(jié)合低氧對(duì)組織細(xì)胞自噬的調(diào)節(jié)作用，系統(tǒng)觀察了不同低氧時(shí)間下大鼠心肌組織細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin－1、LC3－Ⅱ的表達(dá)變化趨勢(shì)，并揭示了自噬在低氧性心肌細(xì)胞凋亡損傷中的作用，為高原心臟病的防治提供了理論指導(dǎo)。但本研究只是對(duì)少數(shù)大鼠心肌組織細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的觀察，缺乏電鏡觀察等更多有力證據(jù)，今后需擴(kuò)大樣本含量，多方面研究自噬在急慢性心肌凋亡損傷中的具體作用機(jī)制。