張倩倩 孟現(xiàn)廣 黃淑紅 黨寧寧

惡性黑素瘤是一種來(lái)源于黑素細(xì)胞的惡性腫瘤，其中95%的黑素瘤發(fā)生在皮膚，而 5%則是發(fā)生在如黏膜、眼睛等非皮膚部位[1]。雖然皮膚黑素瘤約占皮膚惡性腫瘤的4%，但死亡率卻占惡性腫瘤死亡率的80%[2]。近年來(lái)，黑素瘤的發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)，我國(guó)每年就有約2萬(wàn)黑素瘤新發(fā)病例[3]。因此，黑素瘤的早期診斷和治療越來(lái)越成為人們研究的熱點(diǎn)。

Bafetinib(INNO-406)是一種有效的雙重Bcr-Lyn抑制劑，可誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病(CML)細(xì)胞的凋亡[4]。Lyn又稱JTK8，是非受體型蛋白酪氨酸激酶SRC家族激酶(SFKs)中的一員，通過(guò)催化ATP上γ-磷酸轉(zhuǎn)移到某些底物蛋白酪氨酸殘基上，使得該蛋白質(zhì)酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，從而將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、遷移等過(guò)程。同時(shí)，Lyn也與一些疾病尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。既往研究表明Lyn在白血病、腎癌、頭頸部鱗癌等多種腫瘤中表達(dá)量增加，并且腫瘤的發(fā)生發(fā)展與Lyn的活性密切相關(guān)，而前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，Lyn在黑素瘤中高表達(dá)。因此我們希望通過(guò)研究Bafetinib是否能夠抑制黑素瘤細(xì)胞UACC62中Lyn的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)其增殖和凋亡產(chǎn)生影響，來(lái)尋找新的治療黑素瘤的藥物。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 人惡性黑素瘤細(xì)胞株UACC62購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。培養(yǎng)液DMEM和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Lyn抑制劑Bafetinib購(gòu)自美國(guó)MCE公司，CCK-8試劑購(gòu)自北京Solarbio公司，RIPA裂解液、蛋白抽提試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技公司。鼠抗人Lyn單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，鼠抗人P-ERK、Bax、Beclin、Bcl-2單克隆抗體和鼠抗人GAPDH克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) UACC62細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的DMEM)中，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，根據(jù)生長(zhǎng)速度每2～3天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于本實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)不同濃度的Bafetinib對(duì)人黑素瘤細(xì)胞UACC62的細(xì)胞活力及增殖速度的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的UACC62細(xì)胞，胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×103/L密度接種于96孔板，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去原有培養(yǎng)基，分別加入含以下濃度Bafetinib的培養(yǎng)液：0.05、0.1、1、10、20、50、100、500 μmol/L各100 μL，每個(gè)濃度設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。建立對(duì)照組，對(duì)照組中只加入100 μL的完全培養(yǎng)液。將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔中各加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處光密度(OD)值。同上方法鋪好96孔板后，一組細(xì)胞加入合適濃度Bafetinib的培養(yǎng)基100 μL作為實(shí)驗(yàn)組，另一組只加入100 μL的完全培養(yǎng)液作為對(duì)照組，測(cè)0、24、48、72 h的OD值，繪制生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bafetinib對(duì)人黑素瘤細(xì)胞UACC62增殖能力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的UACC62細(xì)胞，胰酶消化后成單細(xì)胞懸液。將約500個(gè)細(xì)胞接種到含有5 mL培養(yǎng)基的10 cm培養(yǎng)皿中。用10 μmol/L的Bafetinib處理細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，未加藥的正常細(xì)胞作為對(duì)照組，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，直到細(xì)胞形成肉眼可見(jiàn)的克隆團(tuán)。然后棄去培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗2～3次，5 mL 4%多聚甲醛固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，最后用自來(lái)水沖洗后室溫晾干。計(jì)數(shù)克隆細(xì)胞團(tuán)，并與對(duì)照組的大小和數(shù)量進(jìn)行比較。

1.2.4 Western blot檢測(cè)Lyn、p-ERK、Bax、Beclin、Bcl-2蛋白的表達(dá) 收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，并進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，每組各取等量的蛋白(20～30 μg)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，分別加入鼠抗人GAPDH單克隆抗體(1∶3000)、鼠抗人P-ERK抗體(1∶1000)、鼠抗人Beclin抗體(1∶1000)、鼠抗人Bax抗體(1∶1000)、鼠抗人Bcl-2抗體(1∶1000)、鼠抗人Lyn抗體(1∶500)，4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜10 min×3次。再分別加入相應(yīng)的二抗(1∶3000)室溫孵育1 h，TBST洗膜10 min×3次，進(jìn)行ECL顯影。應(yīng)用ImageJ軟件，通過(guò)與內(nèi)參GAPDH灰度的比值，對(duì)Lyn、P-ERK、Bax、Beclin、Bcl-2蛋白進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 5軟件分析，數(shù)據(jù)分析采用t檢驗(yàn)，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 Bafetinib對(duì)黑素瘤細(xì)胞UACC62的細(xì)胞活力的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示：當(dāng)Bafetinib濃度<1μmol/L時(shí)，對(duì)黑素瘤細(xì)胞UACC62的細(xì)胞活力無(wú)明顯影響；當(dāng)Bafetinib濃度在1～50 μmol/L時(shí)，明顯抑制了黑素瘤細(xì)胞UACC62的細(xì)胞活力，且呈劑量依賴性；當(dāng)Bafetinib濃度>50 μmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用最大，提示Bafetinib已達(dá)到黑素瘤細(xì)胞UACC62的最大致死量(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2 Bafetinib能夠抑制黑素瘤細(xì)胞UACC62的增殖 CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示：與正常對(duì)照組相比，當(dāng)UACC62細(xì)胞經(jīng)過(guò)濃度為10 μmol/L Bafetinib處理后，其OD值明顯增高(P<0.05)(圖2a)；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比較，當(dāng)UACC62細(xì)胞經(jīng)過(guò)濃度為10 μmol/L Bafetinib處理后，細(xì)胞的克隆形成能力受到明顯抑制(P<0.05)。見(jiàn)圖2b、2c。

2.3 Bafetinib能夠有效降低UACC62細(xì)胞中Lyn的表達(dá)，并通過(guò)抑制ERK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡 Western blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，當(dāng)濃度為10 μmol/L Bafetinib處理后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的Lyn、P-ERK表達(dá)水平明顯降低，提示Bafetinib能夠有效降低Lyn的表達(dá)，并能夠抑制ERK信號(hào)通路；同時(shí)促凋亡蛋白Bax、Beclin1的表達(dá)上調(diào)，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖3a、3b。

圖1 不同濃度的Bafetinib對(duì)黑素瘤細(xì)胞UACC62細(xì)胞活力的影響* vs對(duì)照組，P<0.05；** vs對(duì)照組，P<0.01圖2 CCK-8實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Bafetinib對(duì)黑素瘤細(xì)胞UACC62增殖能力的影響*vs對(duì)照組，P<0.05

圖3 Bafetinib通過(guò)ERK信號(hào)通路誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞UACC62的凋亡 *vs對(duì)照組，P<0.05

3 討論

黑素瘤的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，早期診斷和治療仍面臨著很多挑戰(zhàn)。雖然目前臨床上治療黑素瘤的藥物有達(dá)卡巴嗪、伊匹單抗(ipilimumab)、達(dá)拉非尼(dabrafenib) 、維羅非尼(vemurafenib)和曲美替尼(trametinib)等，但是仍然存在一些安全性問(wèn)題[5]。Bafetinib作為一種抗腫瘤新藥，已有研究證實(shí)其對(duì)白血病細(xì)胞有抑制增殖及促進(jìn)凋亡的作用；同時(shí)對(duì)腦腫瘤細(xì)胞也有一定的抑制作用[6]。另有研究表明Bafetinib可以抑制ABCB1和ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥性[7]。新的研究發(fā)現(xiàn)Bafetinib可以抑制PAR2-TrPV4偶聯(lián)，減少機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏，達(dá)到鎮(zhèn)痛效果[8]；還能夠抑制嗜酸粒細(xì)胞反應(yīng)，在抗過(guò)敏治療中可能起著輔助作用[9]。但Bafetinib在黑素瘤中的作用尚無(wú)研究，因此，我們希望通過(guò)研究Lyn抑制劑Bafetinib對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞UACC62增殖和凋亡的影響，初步了解Bafetinib在惡性黑素瘤的作用機(jī)制，從而為黑素瘤的治療提供一個(gè)新方向。

本實(shí)驗(yàn)中，我們用不同濃度的Bafetinib處理黑素瘤細(xì)胞株UACC62后，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Bafetinib濃度<1 μmol/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力與對(duì)照組無(wú)明顯差異；當(dāng)Bafetinib濃度在1～50 μmol/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，且細(xì)胞活力隨著B(niǎo)afetinib濃度的增加而降低；當(dāng)Bafetinib濃度>50 μmol/L，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活力較對(duì)照組顯著降低，但細(xì)胞活力并未隨著B(niǎo)afetinib濃度的增加而降低。這些提示Bafetinib抑制黑素瘤細(xì)胞UACC62的生長(zhǎng)需要一定的濃度，并且在一定濃度范圍內(nèi)(1～50 μmol/L)，黑素瘤細(xì)胞株UACC62的細(xì)胞活力隨著B(niǎo)afetinib濃度的增加而降低，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性，但并非濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，當(dāng)Bafetinib濃度達(dá)到50 μmol/L時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用最大，即達(dá)到黑素瘤細(xì)胞UACC62的最大致死量。CCK-8和克隆形成實(shí)驗(yàn)表明：Bafetinib能夠抑制黑素瘤細(xì)胞UACC62的增殖。為進(jìn)一步研究Bafetinib對(duì)黑素瘤細(xì)胞UACC62信號(hào)通路及凋亡的影響，我們應(yīng)用Western blot，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，用Bafetinib處理的細(xì)胞其Lyn的表達(dá)量明顯降低，表明Bafetinib可以有效抑制Lyn的表達(dá)；P-ERK的表達(dá)量明顯降低，即ERK的磷酸化水平被抑制，提示Bafetinib能夠抑制ERK信號(hào)通路的活化；同時(shí)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量明顯降低，而促凋亡蛋白Bax、Beclin1的表達(dá)量明顯增加，提示Bafetinib能夠誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果均表明，Lyn抑制劑Bafetinib可以影響黑素瘤細(xì)胞UACC62的增殖和凋亡，并且是通過(guò)抑制ERK信號(hào)通路的活化發(fā)揮其抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，但具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，Lyn抑制劑Bafetinib能夠有效降低黑素瘤細(xì)胞UACC62中Lyn的表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖能力，并通過(guò)抑制ERK信號(hào)通路的活化，誘導(dǎo)其凋亡，從而為Bafetinib抗黑素瘤研究提供了依據(jù)。