朱丹鳳，王園園，崔樹茂*，毛丙永，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇無錫，214122) 2(無限極(中國(guó))有限公司，廣東廣州 510623)

羅伊氏乳桿菌屬于乳酸桿菌，革蘭氏陽性菌，無芽孢，不運(yùn)動(dòng)，方形桿狀，屬于專性異型發(fā)酵，生長(zhǎng)過程中會(huì)產(chǎn)生CO2、乳酸、乙酸和乙醇等。羅伊氏乳桿菌是目前報(bào)道的可存在于所有脊椎動(dòng)物和哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)的乳酸桿菌，在厭氧或非厭氧環(huán)境中都可以生長(zhǎng)[1-2]。

羅伊氏乳桿菌是多氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷菌株，不能直接利用外源蛋白質(zhì)和無機(jī)氮源，必須通過降解外源蛋白質(zhì)或肽，以保證菌體正常生長(zhǎng)代謝對(duì)氨基酸的需要。通常乳酸菌編碼相對(duì)完善的蛋白水解系統(tǒng)，主要由3部分組成[3]：細(xì)胞壁表面的蛋白水解酶，不同類型的氨基酸、二肽、三肽和寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，以及一些胞內(nèi)肽酶。首先由細(xì)胞壁蛋白水解酶降解外源蛋白形成寡肽和氨基酸，目前大多數(shù)研究都是乳酸菌在乳制品中的蛋白水解體系，牛乳中的胞外蛋白酶主要水解酪蛋白[4]，其他益生菌株對(duì)氮源的利用情況很少涉及，之后通過特定的肽轉(zhuǎn)運(yùn)和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，寡肽通過寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Opp轉(zhuǎn)運(yùn)，二肽或三肽則是DtpP和DtpT，多數(shù)研究證明寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)Opp對(duì)于菌株利用是最重要的[5-6]。最后由胞內(nèi)各種肽酶將肽降解為更小的肽和游離氨基酸以提供給菌體生長(zhǎng)利用[7]。但是，乳酸菌的蛋白水解系統(tǒng)具有很強(qiáng)的菌株特異性，乳酸菌為適應(yīng)各自的生長(zhǎng)環(huán)境，在進(jìn)化過程中發(fā)生諸如點(diǎn)突變、重組或者重復(fù)序列變異等自身基因的變異，及基因水平轉(zhuǎn)移，通過獲得新基因來適應(yīng)環(huán)境[8]；也有一些乳酸菌因生長(zhǎng)環(huán)境營(yíng)養(yǎng)豐富，致使一些“無用”的基因不斷鈍化、衰退、缺失。因此，不同環(huán)境中的乳酸菌逐漸形成了菌株和環(huán)境特異的氮代謝系統(tǒng)，氮源的利用一直是制約乳酸菌生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素。羅伊氏乳桿菌138-1篩選自長(zhǎng)壽老人腸道，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)被證明具有降血糖的功效，具有潛在的生產(chǎn)和應(yīng)用價(jià)值。但是，該菌種能夠利用什么樣的氮源，其對(duì)氮源利用具有什么樣的特征？目前還是未知。

不同種類的氮源經(jīng)過不同的水解工藝后，會(huì)產(chǎn)生不同組成的氨基酸、寡肽和多肽。羅伊氏乳桿菌氮代謝系統(tǒng)的底物特異性決定其可能對(duì)不同氮源具有不同的利用效率。該文將系統(tǒng)探討羅伊氏乳桿菌138-1對(duì)不同種類氮源的利用效率，并進(jìn)一步分析有效利用的氮源組分，不僅可以為乳酸菌的生產(chǎn)提供氮源優(yōu)選策略，而且可以指導(dǎo)氮源生產(chǎn)企業(yè)。根據(jù)菌株對(duì)氮源種類和分子量的要求優(yōu)化水解工藝，讓所生產(chǎn)氮源更適宜菌株的增殖。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

羅伊氏乳桿菌138-1(CCFM8631)，江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心保藏。

1.1.2 試劑

葡萄糖測(cè)定試劑盒，上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；其余化學(xué)試劑均是分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；市售氮源見表1。

表1 試驗(yàn)氮源Table 1 Sources of different nitrogen sources

1.2 儀器與設(shè)備

GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FE20型pH計(jì)、EL3002型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MS 3 basic型渦旋振蕩器，德國(guó)IKA公司；l?ser-om806m型冰點(diǎn)滲透壓測(cè)定儀，德國(guó)l?ser公司；T&J-Minipod 1L×8型迷你平行發(fā)酵罐，迪必爾生物工程(上海)有限公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；ZHJH-C1115B型超凈工作臺(tái)，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；高效液相色譜儀Ag1100，美國(guó)安捷倫公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的活化與培養(yǎng)

從凍存的甘油保菌管內(nèi)，用接種環(huán)挑取少量菌液于MRS固體培養(yǎng)基劃線，將平板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。從長(zhǎng)出的菌落中挑取單菌落，接種于5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，在恒溫37 ℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)18～24 h。重復(fù)上述操作1次得到活化后的種子液。

1.3.2 羅伊氏乳桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將上述種子液以2%的接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，置于恒溫37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 h取樣，一部分樣品測(cè)定菌液的OD600值，當(dāng)吸光度值超過0.8時(shí)，將菌懸液稀釋一定倍數(shù)，使稀釋后的吸光度值在0.2～0.8，菌懸液的OD600值為測(cè)定的吸光度值乘以稀釋倍數(shù)。然后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制菌株生長(zhǎng)曲線。另一部分樣品經(jīng)離心去除菌體后，測(cè)定發(fā)酵中的葡萄糖含量和總酸含量，計(jì)算羅伊氏乳桿菌發(fā)酵過程中代謝單位葡萄糖的產(chǎn)酸量。

1.3.3 羅伊氏乳桿菌分批培養(yǎng)最高生物量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取25 g/L上述不同氮源，替換MRS培養(yǎng)基中的所有氮源(胰酪蛋白胨、酵母粉和牛肉膏)，配制成不同氮源的培養(yǎng)基。以2%的接種量接入待實(shí)驗(yàn)菌株，置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待菌株生長(zhǎng)至穩(wěn)定期前后(6、8和10 h)，取樣測(cè)定OD600，以MRS為對(duì)照。

1.3.4 羅伊氏乳桿菌恒pH自動(dòng)反饋補(bǔ)糖生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

根據(jù)1.3.3配制不同氮源的培養(yǎng)基，以相同的量置于T&J-Minipod 1L×8型迷你平行發(fā)酵罐。以5%的接種量接入待實(shí)驗(yàn)菌株，通過發(fā)酵罐的控制系統(tǒng)，恒pH 6.0自動(dòng)反饋補(bǔ)糖培養(yǎng)，確保菌體在增殖過程中不受到酸和碳源缺乏的抑制[9]。具體操作如下：

分別配制400 g/L(C堿)的NaOH溶液和400 g/L(C料)的葡萄糖溶液，并分別置于補(bǔ)堿瓶和補(bǔ)糖瓶。開啟發(fā)酵罐補(bǔ)糖與補(bǔ)堿的關(guān)聯(lián)系統(tǒng),關(guān)聯(lián)比例(k)根據(jù)以下公式設(shè)置：

式中：40表示NaOH的摩爾質(zhì)量，g/mol；W，表示菌株代謝單位質(zhì)量的葡萄糖產(chǎn)生酸的摩爾質(zhì)量，mol/g，該值由1.3.2測(cè)定得到。恒pH自動(dòng)反饋補(bǔ)糖過程中，每2 h取樣，分別測(cè)定菌液OD600、發(fā)酵液葡萄糖含量及滲透壓，并在菌液濃度達(dá)到最高時(shí)，通過平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定發(fā)酵液活菌數(shù),并保存發(fā)酵前和發(fā)酵后的發(fā)酵液，用于測(cè)定氨基酸和肽組成變化。

1.3.5 發(fā)酵液氮源組成分析

根據(jù)LIU等的方法，進(jìn)行發(fā)酵液氨基酸和肽組成的測(cè)定[10]。氨基酸測(cè)定操作如下：色譜柱為5 μm ODS HYPERSIL(250 mm×4.6 mm)，柱溫40℃，流動(dòng)相A相：將8.0 g結(jié)晶乙酸鈉加入1 000 mL水?dāng)嚢枋蛊涑浞秩芙?，之后在燒杯中加?25 μL三乙胺，邊攪拌邊滴加體積分?jǐn)?shù)為5%的醋酸，將pH值調(diào)到7.2±0.05；最后加5 mL四氫呋喃，混合后備用。流動(dòng)相B相：將8.0 g結(jié)晶乙酸鈉加入400 mL水?dāng)嚢枋蛊涑浞秩芙?，同樣滴加體積分?jǐn)?shù)為2%醋酸將pH值調(diào)到7.2±0.05；將此溶液加入至800 mL乙腈和800 mL甲醇，混合后備用。樣品前處理：取1 mL樣液(根據(jù)最終氨基酸總量對(duì)樣品進(jìn)行稀釋)，加入1 mL 100 g/L三氯乙酸(TCA)進(jìn)行1∶1稀釋，記錄稀釋倍數(shù)。室溫下放置1 h,用0.22 μm針頭式濾器過濾。濾液取1 mL轉(zhuǎn)移入1.5 mL的離心管中，離心(15 000 r/min，30 min)。取出后，移取400 μL于液相小瓶中，蓋上液相小瓶帽。

肽組成測(cè)定如下：色譜柱為TSKgel 2000 SWXL(300 mm×7.8 mm)，流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1混合溶液，流速設(shè)置為0.5 mL/min，柱溫是30 ℃，紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為220 nm。

1.3.6 發(fā)酵液葡萄糖測(cè)定

采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法測(cè)定發(fā)酵液中的葡萄糖濃度，按照葡萄糖測(cè)定試劑盒的說明，具體操作如下：等體積混合試劑1和試劑2，分裝成1 mL的測(cè)試管，樣品管加入10 μL待測(cè)樣品，標(biāo)準(zhǔn)管加入10 μL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，空白管加入10 μL蒸餾水。37 ℃水浴10 min，用空白管調(diào)零，在505 nm下測(cè)定樣品管和標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度，通過以下公式計(jì)算得到葡萄糖的濃度：

1.3.7 發(fā)酵液滲透壓測(cè)定

發(fā)酵液離心后取100 μL用滲透壓測(cè)定儀直接測(cè)定。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)中每個(gè)實(shí)驗(yàn)值的測(cè)定均為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅伊氏乳桿菌生長(zhǎng)曲線

按照1.3.2所述方法，對(duì)羅伊氏乳桿菌138-1進(jìn)行生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。從0 h開始，每2 h測(cè)1次OD600，直至菌體不再生長(zhǎng)為止，繪制的生長(zhǎng)曲線如下圖1。0～2 h為延滯期，菌體生長(zhǎng)緩慢；2～8 h為指數(shù)生長(zhǎng)期，菌體快速生長(zhǎng)繁殖；8～12 h為穩(wěn)定期，菌體生長(zhǎng)量達(dá)到最大，并且基本保持恒定；12 h之后菌體進(jìn)入衰亡期。

圖1 羅伊氏乳桿菌138-1的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus reuteri 138-1

2.2 羅伊氏乳桿菌利用不同氮源初步分析

以不同氮源發(fā)酵液分批培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌138-1，根據(jù)生長(zhǎng)過程的最高生物量初步分析其對(duì)21種不同氮源的利用效率，結(jié)果如表2所示。

表2 不同氮源發(fā)酵液分批羅伊氏乳桿菌138-1的最高生物量Table 2 Effects of Lactobacillus reuteri 138-1 on theproliferation of different nitrogen sources

羅伊氏乳桿菌138-1對(duì)酵母提取物、酵母蛋白103、酵母浸粉528、酵母浸粉803具有最高的利用效率，其次是胰蛋白胨，對(duì)其他種類的氮源利用效果較差，或者基本不利用氮源。表明羅伊氏乳桿菌對(duì)不同種類的氮源具有偏好性，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)同一類別氮源對(duì)菌株的增殖效果有差異。可能是同一類別的氮源經(jīng)不同的水解工藝，產(chǎn)生的氨基酸和多肽組成不同，也說明了菌株可利用的氮源相對(duì)分子質(zhì)量可能具有偏好性。

在分批培養(yǎng)過程中，發(fā)酵液pH值的降低會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)，即氮源還未被利用完全，菌株即因酸積累停止生長(zhǎng)。4種酵母類氮源、胰蛋白胨氮源培養(yǎng)基與對(duì)照MRS培養(yǎng)基分批培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌最高生物量沒有顯著差異，可能是因?yàn)椴煌吹目杀挥行Ю玫某煞趾坎煌?，也可能是因?yàn)椴煌吹木彌_能力不同。因此需要通過恒pH 6.0(解除酸抑制)并補(bǔ)糖(自動(dòng)反饋補(bǔ)料補(bǔ)充碳源)的培養(yǎng)方式，進(jìn)一步分析上述氮源對(duì)羅伊氏乳桿菌的增殖效率。

2.3 羅伊氏乳桿菌氮源利用的選擇性分析

采用恒pH自動(dòng)反饋補(bǔ)糖培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌138-1進(jìn)一步分析其利用4種酵母類氮源和胰蛋白胨的增殖效率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 羅伊氏乳桿菌138-1利用不同氮源恒pH補(bǔ)糖培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of Lactobacillus reuteri 138-1 using different nitrogen sources with constant pH and automatic feedback feeding culture

羅伊氏乳桿菌138-1利用酵母類氮源的生長(zhǎng)速率和最大生物量顯著高于胰蛋白胨和MRS培養(yǎng)基，其中利用酵母蛋白528和酵母提取物生長(zhǎng)的最大生物量最高，OD600分別達(dá)到13.10±0.32和13.40±0.13，是胰蛋白胨和MRS培養(yǎng)基的3倍左右。但是，該結(jié)果不能充分說明羅伊氏乳桿菌138-1對(duì)酵母提取物和酵母浸粉528的選擇性最好，菌株生長(zhǎng)至最大生物量時(shí)也會(huì)受到發(fā)酵體系底物濃度、滲透壓和生長(zhǎng)因子的影響。

通過連續(xù)測(cè)定發(fā)酵過程中發(fā)酵液的葡萄糖質(zhì)量濃度(圖3)，發(fā)現(xiàn)菌株利用不同氮源發(fā)酵過程中葡萄糖含量在一定范圍內(nèi)變化，但均沒有出現(xiàn)過高或過低的情況。表明自動(dòng)反饋補(bǔ)糖培養(yǎng)方式可以根據(jù)菌體生長(zhǎng)過程中對(duì)糖的需求自動(dòng)補(bǔ)糖，使糖含量保持在一個(gè)穩(wěn)定的范圍，證實(shí)了該培養(yǎng)方式的可靠性，也排除了糖含量不足對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。通過測(cè)定各氮源發(fā)酵培養(yǎng)基在菌株停止生長(zhǎng)時(shí)的滲透壓，發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌138-1利用酵母浸粉528生長(zhǎng)至最高生物量時(shí)，發(fā)酵液的滲透壓最高，達(dá)到(1 618±15) mOsm/kg。根據(jù)菌株的耐滲透壓實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)直至MRS培養(yǎng)基添加NaCl濃度為36 g/L(約為1 600 mOsm/kg)，羅伊氏乳桿菌138-1依然可以生長(zhǎng)，排除滲透壓的影響，證實(shí)各氮源培養(yǎng)基中菌株停止生長(zhǎng)不是因?yàn)闈B透壓的影響。

圖3 恒pH自動(dòng)反饋補(bǔ)糖培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌138-1生長(zhǎng)過程發(fā)酵液糖含量的變化Fig.3 Changes of glucose content in fermentation broth of Lactobacillus reuteri 138-1 during constant pH and automatic feedback feeding culture

眾所周知，生長(zhǎng)因子是菌株生長(zhǎng)必不可少的微量物質(zhì)，但微生物本身卻不可以合成，如果菌株生長(zhǎng)缺乏生長(zhǎng)因子的話，蛋白水解系統(tǒng)中的酶系表達(dá)會(huì)受影響，進(jìn)而嚴(yán)重影響其代謝增殖水平。酵母提取物等氮源通常被認(rèn)為是富含生長(zhǎng)因子的氮源，其對(duì)羅伊氏乳桿菌138-1的增殖效率高可能是因?yàn)槠涓缓L(zhǎng)因子的原因。為了探究菌株增殖濃度的不同是否是受生長(zhǎng)因子缺乏的影響，將增殖效果差的氮源與可能含生長(zhǎng)因子的酵母類氮源1∶1復(fù)合分析其對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的增殖效率的影響(圖4)。如果增殖效果差的氮源確是因?yàn)榈慈狈ιL(zhǎng)因子所致，且酵母類氮源富含生長(zhǎng)因子，則兩者氮源復(fù)合后，生長(zhǎng)因子會(huì)促進(jìn)實(shí)驗(yàn)菌株對(duì)效果差的氮源的利用，菌株利用復(fù)合氮源的最大生物量會(huì)與利用酵母類氮源相同，甚至更高；如果菌株利用各氮源的差異不是由于生長(zhǎng)因子的缺乏所致，導(dǎo)致兩者復(fù)合后，菌株利用復(fù)合氮源的最大生物量是利用各自氮源的最大生物量的一半相加之和。

圖4 恒pH自動(dòng)反饋補(bǔ)糖培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌138-1利用復(fù)合氮源的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of Lactobacillus reuteri 138 - 1 with compound nitrogen sources during constant pH and automatic feedback feeding culture

通過恒pH自動(dòng)反饋補(bǔ)糖培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌138-1利用酵母浸粉528與其他氮源復(fù)合的增殖效率，結(jié)果顯示，復(fù)合氮源并沒有提高菌株的生長(zhǎng)速率及最大生物量。說明增殖效果差的氮源不是由于缺乏生長(zhǎng)因子，而是本身可被羅伊氏乳桿菌138-1利用的有效氮源含量少導(dǎo)致。

2.4 羅伊氏乳桿菌對(duì)氮源利用的特征

通過羅伊氏乳桿菌138-1對(duì)不同氮源的選擇性分析，證實(shí)各氮源被利用的差異，是因?yàn)楦鞯粗斜涣_伊氏乳桿菌有效利用的氮源成分含量不同所致，通過分析各氮源的多肽組成(如表3)，發(fā)現(xiàn)每種氮源的肽分子質(zhì)量分布雖有差異，但分子量小于2 000 Da的多肽含量均豐富，最顯著的差異是酵母類氮源中氨基酸含量高。但是，以酵母浸粉528氮源研究氨基酸對(duì)羅伊氏乳桿菌138-1的影響，發(fā)現(xiàn)菌株發(fā)酵前后，氨基酸的種類和含量并沒有顯著降低，其他氮源的氨基酸種類和含量也很豐富(文中未列出)，說明氨基酸并不是限制其生長(zhǎng)的因素。

表3 不同氮源發(fā)酵前后HPLC分析Table 3 Fermentation before and after of HPLC analysis with different nitrogen sources

PICON等[3]發(fā)現(xiàn)，24株乳球菌中，有18株菌株含有Opp和Dpp，肽酶的活力是最高的。杜越歐等[6]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌主要利用氮源中的多肽，在未添加和添加了多肽的培養(yǎng)基中，乳酸菌的關(guān)鍵酶基因表達(dá)有顯著差異，說明肽含量是乳酸菌生長(zhǎng)的一個(gè)限制因素。通過分析發(fā)酵前后各氮源多肽的變化，發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳桿菌主要利用分子質(zhì)量在1 000 Da以下的肽，且對(duì)500 Da以下的小分子肽利用率最高。1分子氨基酸平均分子質(zhì)量為120 Da左右，即羅伊氏乳桿菌138-1僅能利用二肽～五肽的小分子肽，大分子肽及蛋白質(zhì)無法利用，且利用的肽的種類主要來自于酵母類蛋白的水解產(chǎn)物，對(duì)其他蛋白水解得到的肽利用很少。酵母類氮源中含有大量的小分子肽，小分子肽通過特定的肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，進(jìn)一步由胞內(nèi)各種肽酶降解為更小的肽和游離氨基酸以提供菌體生長(zhǎng)利用。一些氨基酸生物合成能力較差的菌株，只能通過編碼更豐富的肽酶和肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來滿足自身生長(zhǎng)的需要[11-12]。羅伊氏乳桿菌不能很好地利用大分子蛋白，可能與其不能合成細(xì)胞壁蛋白水解酶有關(guān)[13]，只有小分子肽才被利用。而且不同蛋白所含的小分子肽即使分子質(zhì)量相近，但由于肽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的底物特異性[14-15]，導(dǎo)致來源不同的氮源即使分子質(zhì)量相同，乳酸菌也不能利用。LIU等[16]對(duì)乳酸菌蛋白水解體系在不同菌種之間的差異性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同菌種甚至菌株之間蛋白水解體系都有明顯的差異。因此對(duì)于上述的復(fù)合氮源結(jié)果也是吻合的，由于添加了酵母類氮源，羅伊氏乳桿菌利用其可利用的肽類，其他種類的氮源仍然不被利用，與是否缺乏生長(zhǎng)因子沒有關(guān)系。

圖5 羅伊氏乳桿菌138-1酵母浸粉528發(fā)酵前后游離氨基酸變化Fig.5 Comparison of free amino acid composition of Lactobacillus reuteri 138-1 with yeast extract 528 fermentation before and after

3 結(jié)論

(1)羅伊氏乳桿菌138-1對(duì)于不同種類的氮源具有偏好性，主要利用酵母類氮源，也可利用胰蛋白胨。對(duì)其他種類的氮源如植物類氮源(大豆蛋白胨、水解植物蛋白等)和動(dòng)物類氮源(魚骨蛋白胨、牛肉蛋白胨、牛骨蛋白胨等)利用效果較差或基本不利用。

(2)通過恒pH自動(dòng)反饋補(bǔ)糖培養(yǎng)羅伊氏乳桿菌138-1，酵母浸粉528和酵母提取物的增殖效率最高，最大生物量分別達(dá)到13.10±0.32和13.40±0.13，是MRS的3倍左右。

(3)羅伊氏乳桿菌138-1氮源利用的選擇性歸因于氮源本身可被菌株有效利用的氮源含量，與生長(zhǎng)因子無關(guān)。

(4)添加了酵母浸粉528的培養(yǎng)基，發(fā)酵前后游離氨基酸都是充足的，證明氨基酸不是羅伊氏乳桿菌的限制性底物，肽含量可能是菌株的生長(zhǎng)限制性底物。而且發(fā)酵前不同種類氮源肽含量均豐富，但是菌株利用卻有差異性。酵母類氮源原料是酵母蛋白，整體的分子質(zhì)量都集中在500 Da以下；乳基蛋白原料是水解酪蛋白，動(dòng)物類蛋白和植物類蛋白原料都是大分子的組織蛋白，可以看出羅伊氏乳桿菌可能對(duì)氮源種類具有偏好性。

(5)羅伊氏乳桿菌138-1對(duì)于同一種類的氮源也具有偏好性。雖然羅伊氏乳桿菌對(duì)微生物類氮源具有偏好性，但是當(dāng)1 000 Da氮源肽段含量豐富時(shí)，菌株的比生長(zhǎng)速率和最高生物量都會(huì)顯著升高，尤其是180～500 Da利用率最高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于工業(yè)上羅伊氏乳桿菌的增殖具有極其重要的指導(dǎo)意義，同時(shí)可以結(jié)合蛋白水解技術(shù)，將廉價(jià)的蛋白原料經(jīng)過蛋白酶水解，使其水解底物的肽段集中在180～500 Da，可以直接用于羅伊氏乳桿菌的增殖培養(yǎng)。對(duì)于不同的氮源，也可以直接推斷出羅伊氏乳桿菌的增殖效果，此舉減少了大量的人力物力，對(duì)未來羅伊氏乳桿菌的利用起到了很大的推動(dòng)作用，不僅僅是羅伊氏乳桿菌，其他的乳酸菌也是可以同樣找到規(guī)律。