趙甜甜,趙雯秋

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇徐州 221004；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州市立醫(yī)院檢驗科，江蘇徐州 221000;3.徐州市中醫(yī)院檢驗科，江蘇徐州 221000)

微小RNA(miRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度為20～25 nt的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，負向調(diào)控靶基因的表達是目前被普遍認可的作用機制。它通過與目標(biāo)mRNA分子的3′-UTR完全或不完全配對來降解靶基因mRNA或抑制其翻譯，調(diào)控細胞的發(fā)育、增殖、分化、凋亡等一系列病理生理過程[1-3]。

有資料顯示miR-221在原發(fā)性肝癌(HCC)患者血清中異常表達，明顯升高[3]。miR-221是最近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，定位于X染色體P11.3區(qū)約1 kb的區(qū)域內(nèi)，成簇分布，具有類似癌癥基因，且以大順反子形式轉(zhuǎn)錄，基本上呈同步表達[4]。又有研究證實miR-221在許多惡性腫瘤細胞中表達明顯上調(diào)，比如肝癌、膠質(zhì)母細胞瘤、前列腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、血液系統(tǒng)腫瘤等 ，表現(xiàn)為一種“通用”的促癌基因[5-7]，但與HCC關(guān)系尤為密切，且在肝良性變組織及炎性組織中未見此增高現(xiàn)象的相關(guān)報道。

國外近期有研究表明，miR-221在HCC患者的組織和血清中明顯上調(diào)，在肝癌細胞增殖、抑制、凋亡及浸潤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[6]。國內(nèi)也有miR-221模擬物轉(zhuǎn)染實現(xiàn)證實它可使更多的HCC細胞系HepG2細胞處于DNA合成的S期，并抑制HepG2的凋亡，進一步確認了miR-221促增殖的特性[8]。但目前，國內(nèi)關(guān)于miR-221與HCC患者各項臨床參數(shù)之間關(guān)系的研究還不夠深入和全面。本研究旨在通過檢測健康者、HCC患者及良性肝病患者的血清miR-221水平，并對檢測結(jié)果進行比較，探討其與HCC患者多項臨床參數(shù)之間的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年1月至2016年5月在本院進行診治的HCC患者71例為肝癌組，其中男49例，女22例；平均年齡(52.0±26.0)歲。根據(jù)2010年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)/美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)肝癌TNM分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期22例，Ⅲ期16例，Ⅳ期21例。選擇同期在本院診治的良性肝病變患者40例為良性肝病組，其中男26例，女14例；平均年齡(48.5±13.5)歲；其中肝血管瘤9例，肝囊腫瘤11例，肝硬化20例。同時選擇同期在本院體檢健康者52例為健康組，其中男33例，女19例；平均年齡(41.5±20.5)歲。本研究獲得本院倫理委員會的批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。3組研究對象年齡和性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集 肝癌組和良性肝病組患者均于入院次日清晨，健康組于體檢當(dāng)日，空腹采集5 mL靜脈全血，500 r/min離心10 min，取上層血清，收集于一次性的無熱原、無內(nèi)毒素EP管內(nèi)。樣品收集后若在1周內(nèi)進行檢測的保存于4 ℃，若不能及時檢測，按1次使用量分裝，凍存于-20 ℃(1個月內(nèi))，或-80 ℃(6個月內(nèi))冰箱待測，避免反復(fù)凍融。

1.2.2總RNA提取 依照TaKaRa生物工程有限公司RNAiso Blood 試劑盒的操作說明提取總RNA約0.45 μg。

1.2.3RNA純度和完整性分析 (1)以變性瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，依照試劑說明書，本實驗完整無損的TotalRNA顯示為一種miRNA，條帶亮度明了，無拖尾。如果miRNA條帶增多或彌散，說明其可能已降解，或者可能存在基因組DNA及其他RNA污染，應(yīng)使用DNase I處理；(2)用30 μL RNase-free水重懸RNA后吸取2 μL在OneDrop1000型紫外分光光度儀上測定吸光度(OD)，檢測純度，OD260/OD280比值在1.7～2.1內(nèi)為好。如果比值小于1.7，說明可能存在蛋白質(zhì)干擾，如果比值大于2.1，說明可能存在DNA干擾。

1.2.4逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)反應(yīng)及實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time PCR)反應(yīng) 依照TaKaRa生物工程有限公司PrimeScriptTMRT reagent Kit(perfect Real Time)試劑盒的操作說明在Genelight 9810 PCR擴增儀上分別進行RT-PCR(10 μL 反應(yīng)體系)和Real-Time PCR(25 μL反應(yīng)體系)檢測。其中RT-PCR擴增使用miR-221逆轉(zhuǎn)錄特異性引物并以U6為內(nèi)參基因，見表1；Real-Time PCR擴增使用PCR特異性引物。

1.2.5miR-221表達的相對變化 采用2-ΔΔCt法(CT值定義為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))分析miR-221表達的相對變化。

表1 RT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.13組研究對象miR-221水平比較 結(jié)果顯示，肝癌組為(10.74±2.45)μg/μL，良性肝病組為(4.19±1.73)μg/μL，健康組為(4.07±1.48)μg/μL。肝癌組明顯高于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但良性肝病組和健康組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.2血清miR-221表達與HCC患者臨床指標(biāo)的關(guān)系 結(jié)果顯示，血清miR-221表達高低與性別、年齡及血清甲胎蛋白(AFP)無關(guān)(P>0.05)，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 不同臨床指標(biāo)的HCC患者血清miR-221表達水平

續(xù)表2 不同臨床指標(biāo)的HCC患者血清miR-221表達水平

2.3血清miR-221在原發(fā)性肝癌中的診斷價值 miR-221檢測原發(fā)性肝癌患者血清的AUCmiR-221值為0.792，根據(jù)最大約登指數(shù)(約登指數(shù)=靈敏度+特異度-1)確定CUT-OFF值為8.59 μg/μL，靈敏度為85.75%，特異度為78.82%。

3 討 論

惡性腫瘤是目前造成人類死亡的主要原因之一，隨著分子生物學(xué)和人類基因組學(xué)的發(fā)展，人們對腫瘤的認識已經(jīng)達到了一個新的高度，大量研究表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都伴有miRNA的異常表達[9]。

miRNA是一類內(nèi)源性，長度為20～25個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，廣泛分布于真核細胞生物中。人類的miRNA約占人類基因組的1%，其中約50%定位于染色體的脆弱區(qū)，而該區(qū)域恰與人類癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10-11]。且在外周血中有豐富的miRNA穩(wěn)定的表達，但由于其內(nèi)源性的結(jié)構(gòu)特性決定了血清中miRNA具有對抗核糖核酸酶的能力，即使經(jīng)歷反復(fù)的凍融、pH值改變等情況仍能維持穩(wěn)定[11]。

miRNA在細胞核內(nèi)經(jīng)RNA聚合酶Ⅱ、Ⅲ催化轉(zhuǎn)錄成具有5′帽結(jié)構(gòu)和3′多聚A尾的初級miRNA，其長度約數(shù)干核苷酸，之后被RNA酶Drosha識別并切割成長約70 nt的具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miRNA，前體miRNA在核轉(zhuǎn)運蛋白5作用下，依賴Ran-GTP方式轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，隨即被另一種RNA酶Dicer剪切成約20 nt的miRNA-miRNA聚體，此二聚體結(jié)合Argonaute蛋白、反式激活反應(yīng)RNA結(jié)合蛋白后被切割成兩條單鏈，其中一條單鏈miRNA游離出復(fù)合體很快被降解，另一條單鏈miRNA作為成熟miRNA參與形成RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RISC)，當(dāng)miRNA完全綁定目標(biāo)信使RNA(mRNA)的3′端非編碼區(qū)時，造成mRNA降解；當(dāng)不完全綁定時，阻遏其轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生基因沉默作用，發(fā)揮獨特的負調(diào)節(jié)基因表達能力[12]。不同的miRNA對細胞生長具有不同的調(diào)控作用，相同的miRNA對不同的細胞株的調(diào)控作用亦不同[13]。

miRNA負向調(diào)控靶基因的表達是目前被普遍認可的作用機制。miR-221亦是通過堿基互補配對原則與靶mRNA結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平引起靶mRNA的降解或者抑制其翻譯成蛋白質(zhì)[14]。其作用其機制可能是通過對P27、CDKNIC/P57、PUMA、Bmf、c-kit、DDIT4等基因來調(diào)控細胞分化周期，抑制細胞凋亡，參與腫瘤的生發(fā)[15]。有研究者通過對比104例HCC患者的90例肝硬化組織、21例正常肝組織及35個HCC衍生的細胞系miRNA、mRNA及相關(guān)蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-221/222在HCC衍生的細胞系中表達上調(diào)最為顯著，并且通過靶向抑制P27(Kip1-CDKN1B)基因和酪氨酸酶受體c-kit基因，增強細胞生長，參與肝癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[16]。在小鼠模型中過表達miR-221/222是通過抑制P27的翻譯而不是轉(zhuǎn)錄，因為P27的mRNA水平?jīng)]有變化。還有相關(guān)研究表明，miR-221在HCC組織中可通過調(diào)控下游靶基因P57的表達，同樣使更多的HCC細胞聚集于S期，從而促進HCC細胞生長[17-18]。本研究通過檢測血清miR-221表達水平分析其與HCC患者多項臨床參數(shù)之間的關(guān)系。由于對miR-221的臨床研究還處于發(fā)展階段，目前尚無健康人血清檢測結(jié)果的參考范圍，本次試驗以ROC曲線得出血清miR-221檢測的CUT-OFF值為8.59 μg/μL，AUCmiR-221為0.792。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-221與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡及血清AFP水平均無關(guān)(P>0.05)。miR-221檢測的靈敏度為85.75%，特異度為78.82%。

綜上所述，miR-221有望作為HCC的一種新型血清標(biāo)記物為臨床診療監(jiān)測提供臨床實驗室支持。