唐韻熙，白亞敏，馬雪豐，毛 慶

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院, 重慶 401121）

喹諾酮類藥物（quinolone）是一類較新的廣譜抗菌藥，由于其抗菌力強(qiáng)、口服吸收好，與其他抗菌藥物無交叉耐藥性，已經(jīng)成為治療細(xì)菌感染性疾病的主要藥物[1]。喹諾酮類藥物按其發(fā)明先后和抗菌性能的不同，可分為一、二、三、四代，環(huán)丙沙星和恩諾沙星均屬于第三代，即在喹諾酮分子的C6位置上引進(jìn)了氟原子，也稱為氟喹諾酮[1-2]。雖然該類藥物對(duì)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌都有較好的抗菌作用，但也存在嚴(yán)重持久性的不良反應(yīng)，包括肌腱損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等[3]，也可致癌、致突變、產(chǎn)生過敏反應(yīng)[4]。隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，獸藥濫用的情況屢見不鮮，雖然中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第235號(hào)中明確規(guī)定，產(chǎn)蛋雞禁用環(huán)丙沙星、恩諾沙星[5]，但養(yǎng)殖戶為了提高動(dòng)物產(chǎn)品產(chǎn)量，將藥物用于飼料添加，或治療家禽疾病，導(dǎo)致了獸藥的殘留，長(zhǎng)期使用該超標(biāo)食品，必定會(huì)給人體健康造成傷害。

近期，重慶、江西、海南等多地雞蛋被檢出違禁獸藥殘留，其中環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟苯尼考檢出率最多，為了保證人們的健康需求，提高獸藥檢測(cè)手段已刻不容緩，目前喹諾酮類藥物的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法[6]、高效液相色譜法（HPLC）[7-8]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS）[9-11]、毛細(xì)管電泳法[12]等，相比之下，高效液相與質(zhì)譜相結(jié)合，通過提供精確的母離子和碎片離子的質(zhì)量數(shù)，推算出可能的化合物分子式，從而對(duì)化合物結(jié)構(gòu)和裂解規(guī)律做進(jìn)一步確證，這不僅提高了喹諾酮類藥物殘留篩查的可靠性，也提高了方法的靈敏度[13]。

本文以雞蛋為基質(zhì)，通過酸化乙腈進(jìn)行前處理，采用HPLC-MS/MS檢測(cè)雞蛋中的獸藥殘留物──恩諾沙星、環(huán)丙沙星，不僅提高了檢測(cè)的檢出限，且對(duì)市場(chǎng)上獸藥殘留的監(jiān)管起到一定的積極作用。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AB SCIEX API4000+三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex公司）；LC-30A型高效液相色譜儀（日本島津）；3-30KS型冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；ML-886渦旋儀（江蘇海門其林貝爾儀器制造公司）；Turbovap LV全自動(dòng)濃縮儀（英國(guó) Biotage公司）；IKA T10勻漿機(jī)（德國(guó)IKA公司）；Milli-q reference 型純水機(jī)（美國(guó) Millipore公司）；十萬分之一電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）。

1.2 試藥

鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào) 130451-201203）；恩諾沙星對(duì)照品（Sigma公司，批號(hào)SZBA336XV）；乙腈（美國(guó)Fisher公司，色譜純）；甲酸（上海安譜）；正己烷（美國(guó)Honeywell公司，色譜純）；實(shí)驗(yàn)用水為自制Milli-q 超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器條件

2.1.1 HPLC條件 色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；進(jìn)樣量：1 μl；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水，流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫程序：0～1.5 min，10%B～40%B，1.5～1.6 min，40%B，1.6～3.6 min，40%B～90%B，3.6～5 min，90%B，5～5.1 min，90%B～10%B，5.1～8 min，10%B，流速為0.3 ml/min。

2.1.2 MS條件 ESI正離子模式；離子源電壓：5500 V；氣簾氣流量：25 psi；離子源溫度：500 ℃；輔助加熱氣（氮?dú)猓┝髁浚?5 psi；霧化氣流量：55 psi；采集數(shù)據(jù)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。其他質(zhì)譜條件見表1。

表1 環(huán)丙沙星、恩諾沙星LC-MS/MS MRM參數(shù)

2.2 溶液的配制

2.2.1 單一對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 分別準(zhǔn)確稱取鹽酸環(huán)丙沙星對(duì)照品11.53 mg、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品10.88 mg，用乙腈定容至10 ml,使其濃度分別為1.039 mg/ml、1.077 mg/ml，將配置好的儲(chǔ)備液置于4 ℃冰箱中冷藏。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密準(zhǔn)確移取0.25 ml環(huán)丙沙星對(duì)照品儲(chǔ)備液、0.10 ml恩諾沙星對(duì)照品儲(chǔ)備液，置入10 ml量瓶，用乙腈定容至刻度，配制成環(huán)丙沙星濃度25.97 μg/ml、恩諾沙星濃度10.77 μg/ml混合對(duì)照品溶液，置于4 ℃冰箱中冷藏。使用時(shí)根據(jù)需要配制成相應(yīng)濃度的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取混合均勻的蛋清蛋黃混合物5 g，于50 ml聚丙烯離心管中，加入20 ml 2%甲酸乙腈溶液，用勻漿機(jī)均質(zhì)1 min，9000 r/min離心10 min。取上清于40 ℃下氮?dú)獯蹈?，加?.0 ml 0.1%甲酸水溶液溶解殘?jiān)?，再? ml乙腈飽和的正己烷去除脂肪，直至下層溶液澄清為止。下層水相過0.22 μm濾膜，取濾液作為供試品溶液。

2.2.4 陰性供試品溶液的制備 取經(jīng)過確證不含恩諾沙星和環(huán)丙沙星的混合均勻的蛋清蛋黃混合物5 g，按2.2.3供試品溶液的制備方法，制得陰性供試品溶液。

陰性供試品溶液、環(huán)丙沙星和恩諾沙星對(duì)照品溶液與供試品溶液的總離子流對(duì)比圖見圖1。

圖1 陰性供試品溶液、環(huán)丙沙星和恩諾沙星對(duì)照品溶液與供試品溶液的總離子流圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 定量限及線性關(guān)系試驗(yàn) 用陰性供試品溶液將2.2.2中環(huán)丙沙星、恩諾沙星混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制成系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在陰性供試品溶液中添加適當(dāng)濃度的環(huán)丙沙星、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得樣品處理后儀器信噪比（S/N）≥10，從而確定儀器定量限；以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，ng/ml），目標(biāo)物分子離子峰的峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得到的線性關(guān)系良好，見表2。

表2 線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、儀器定量限

2.3.2 回收率試驗(yàn) 在未檢出環(huán)丙沙星和恩諾沙星的雞蛋樣品中分別添加環(huán)丙沙星含量1.0388，2.597 μg/kg，恩諾沙星含量0.4308，1.07μg/kg的混合對(duì)照品溶液，按本方法測(cè)定，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果環(huán)丙沙星和恩諾沙星的回收率分別為90.7%～107.6%和80.1%～101.6%、85.0%～105.4%和86.9%～103.6%，RSD分別為6.0%，10.1%和8.7%，8.5%。

2.4 樣品測(cè)定

利用本文建立的分析方法，對(duì)市場(chǎng)上近100批雞蛋進(jìn)行了測(cè)定。其中有6批為陽性樣品，環(huán)丙沙星的檢出含量為10.68～63 μg/kg，恩諾沙星的檢出含量為2.36～7.13 μg/kg。

3 討論

3.1 前處理方法的選擇

喹諾酮屬于高極性化合物，可溶于極性有機(jī)溶劑，而不溶于非極性溶劑，常采用的提取溶劑有乙酸乙酯、乙腈、甲醇、丙酮、酸堿性水溶液等，由于雞蛋中含較多的蛋白質(zhì)和脂肪，在提取樣品時(shí)考慮采用酸化乙腈為溶劑除蛋白，采用正己烷對(duì)提取液脫脂。有研究表明，酸化乙腈對(duì)喹諾酮的提取率有提高作用[14]。

3.2 液相色譜條件的優(yōu)化

選用Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱，以0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水為流動(dòng)相，通過調(diào)節(jié)有機(jī)相與水相的比例，從而優(yōu)化色譜條件；在流動(dòng)相中加入甲酸也可在一定程度上提高檢測(cè)的靈敏度及待測(cè)物的離子化效率。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

3.3.1 定量、定性離子的選擇 在ESI正離子模式下對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星結(jié)構(gòu)進(jìn)行電離，針泵連續(xù)進(jìn)樣，對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星混合對(duì)照品溶液（50 ng/ml）進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，確定其母離子。再對(duì)確定的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，通過優(yōu)化去簇電壓和碰撞能而使其子離子有較強(qiáng)的離子強(qiáng)度，經(jīng)優(yōu)化后的環(huán)丙沙星和恩諾沙星質(zhì)譜參數(shù)見表1。

3.3.2 環(huán)丙沙星和恩諾沙星的子離子產(chǎn)生途徑 在正離子模式下，環(huán)丙沙星和恩諾沙星易分別形成分子離子峰[M+H]+m/z332.2和m/z360.3，兩個(gè)分子離子峰易失去CO2后產(chǎn)生碎片離子m/z288.2和m/z316.3，m/z288.2和m/z316.3再經(jīng)過兩次四元環(huán)氫重排后得到m/z245.1和m/z245.3[14]。

4 結(jié)論

本文建立了用于檢測(cè)雞蛋中環(huán)丙沙星和恩諾沙星殘留量的HPLC-MS/MS方法。該方法前處理過程較為簡(jiǎn)單，通過色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化，提高了方法的靈敏度，同時(shí)，在試驗(yàn)線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系、回收率較好，分析時(shí)間短，為環(huán)丙沙星、恩諾沙星殘留的快速檢測(cè)提供了可靠方法。