廖金英,肖光景,郭振亞,黃科榮

(福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州350002)

小菜蛾對(duì)Bt(Bacillus thuringiensis)的抗性已成為全球關(guān)注的問題。昆蟲可通過多種方式對(duì)Bt δ-內(nèi)毒素(Cry)蛋白產(chǎn)生抗性。昆蟲被誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌肽是其自身建立的免疫防線(Iwanaga et al.,2005),防御物質(zhì)抗菌肽的生成至少需要1-3 h(Lavine et al.,2002),12-48 h后達(dá)到最高水平(Haine et al.,2008)。在個(gè)別昆蟲中,這種誘導(dǎo)響應(yīng)可以持續(xù)幾周,如大黃蜂(Korner et al.,2004)和粉虱(Haine et al.,2008)至少14 d,蜻蜓可持續(xù)到44 d(Bulet et al.,1992)。前人研究發(fā)現(xiàn)昆蟲在受到細(xì)菌微生物或者其他外界條件刺激后,體內(nèi)產(chǎn)生具有抗菌活性的抗菌肽(Steiner et al.,1981),阮華波等(2012)通過菌液注射、菌液飼喂、紫外線照射和超聲波誘導(dǎo)的方法,使黃粉蟲幼蟲產(chǎn)生有較大抑菌活性差異的抗菌肽。昆蟲在未經(jīng)誘導(dǎo)時(shí),自身體內(nèi)也含有一定數(shù)量的抑菌活性較低的抗菌肽,當(dāng)受到外源病菌等的刺激時(shí),昆蟲啟動(dòng)體內(nèi)機(jī)體防御系統(tǒng),免疫反應(yīng)生成抗菌肽以抵御侵害(Bulet et al.,2005)。已有研究結(jié)果表明,Bt侵染小菜蛾,可影響小菜蛾體內(nèi)抗菌肽的產(chǎn)生(鄭志華等,2016),并且小菜蛾抗菌肽對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要的協(xié)調(diào)作用(Li et al.,2012),可知抗菌肽與小菜蛾對(duì)Bt產(chǎn)生抗性有不容忽視的關(guān)系,但其具體機(jī)制還不明確。

目前主要采用離心、超濾、透析、尺寸排阻色譜法、離子交換色譜法、固相萃取法、反向高效液相色譜法等方法分離純化抗菌肽,張建新等(2016)采用大孔吸附樹脂法對(duì)黃粉蟲幼蟲抗菌肽進(jìn)行分離純化,李哲等(2012)采用Sephacryl-100聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠法對(duì)貽貝抗菌肽進(jìn)行分離純化,均獲得較純的抗菌肽。

本試驗(yàn)比較小菜蛾抗Cry2Ad毒素品系和敏感品系抗菌肽含量和抑菌活性的差異,初步探討抗菌肽與小菜蛾對(duì)Bt抗性的關(guān)系,并對(duì)抗Cry2Ad毒素小菜蛾進(jìn)行分離、純化,研究其活性,以期通過抗菌肽的研究探索治理抗Bt小菜蛾的途徑和策略。而高效、廣譜抗菌活性小菜蛾抗菌肽的發(fā)現(xiàn)和利用也將對(duì)抑菌化合物的開發(fā)有重要意義。

1 材料

1.1 供試蟲源

敏感品系：小菜蛾敏感品系(Fuzhou-S)由福建農(nóng)林大學(xué)應(yīng)用生態(tài)研究所提供,該品系原始種群采集自福州(26.08°N,119.28°E)田間包菜(Brassica oleracea var.capitata)上(You et al.,2013),在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用盆種蘿卜苗飼養(yǎng),飼養(yǎng)條件溫度(25±1)℃,濕度(75±2)%,并且L∶D＝16 h∶8 h,飼養(yǎng)繁殖期間從未接觸過任何藥劑。

抗性品系：由本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)通過給Fuzhou-S品系喂食Cry2Ad毒素蛋白而選擇獲得具有抗Cry2Ad毒素的小菜蛾抗性品系(Fuzhou-R2Ad),相對(duì)于敏感品系Fuzhou-S抗性倍數(shù)大約120倍。飼養(yǎng)條件同敏感品系,現(xiàn)已抗性汰選70代以上。長(zhǎng)期飼喂篩選出抗Cry2Ad毒素的小菜蛾Fuzhou-R2Ad品系。

1.2 Bt菌株和毒素

Bt(B.thuringiensis)菌株BRC-HZP10由福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

用于小菜蛾抗性篩選和生物測(cè)定的Cry2Ad毒素來(lái)源于Bt菌株BRC-HZP10,經(jīng)過提取、分離和純化,使用時(shí)用含有0.1%Triton X-100的純水稀釋。

1.3 供試菌株

大腸埃希氏菌Escherichia coli,革蘭陰性桿菌,南京茂捷微生物科技有限公司提供。

金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus,革蘭陽(yáng)性球菌,南京茂捷微生物科技有限公司提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 小菜蛾抗菌肽提取

將健康Fuzhou-R2Ad品系和Fuzhou-A品系小菜蛾3齡幼蟲挑選入一次性塑料杯[杯口×杯底×杯高：78 mm×51 mm×82 mm]中,饑餓處理2 h。在生長(zhǎng)良好的盆栽蘿卜苗上均勻噴施Cry2Ad毒素(濃度為100 μg·mL-1),并放置晾干。將饑餓處理后的小菜蛾轉(zhuǎn)接入盆栽蘿卜苗上,置培養(yǎng)箱中溫度(25±1)℃,濕度(75±2)%,光周期L∶D＝16 h∶8 h飼養(yǎng),72 h后,收集存活小菜蛾幼蟲稱取體重,然后置于1.5 mL離心管中,每個(gè)離心管放置10頭小菜蛾幼蟲,冷凍保存,以備提取抗菌肽。

在裝有小菜蛾幼蟲的離心管中,加入0.2 mL以無(wú)菌水配制的0.1 g·mL-1抗壞血酸溶液和0.2 mL pH為5.0的乙酸銨緩沖液,用研磨棒充分碾磨成勻漿。將勻漿液放入100℃水浴5 min,取出后立即于離心機(jī)中1 000 r·min-1、4℃離心30 min。用移液器吸取上清液,此上清液即為抗菌肽的粗提物,用截留量為20 KDa的超濾離心管過濾,收集下層過濾液于1.5 mL離心管中,置冰箱4℃短期保持(王立新等,2008)。

2.2 抗菌肽含量測(cè)定

根據(jù)Bradford(1976)的考馬斯亮藍(lán)法,配制考馬斯亮藍(lán)G-250試液。取牛血清蛋白和純化水配比成濃度分別為 0、200、400、600、800、1 000 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液,顯色 2 min 后,以純水作為對(duì)照,在595 nm處測(cè)吸光值。以牛血清蛋白含量(μg)為橫坐標(biāo),OD595值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,用DPS統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)、95%置信限。標(biāo)準(zhǔn)曲線的公式為：y＝0.0006x+0.2115,R2＝0.9903?？捎米贤夥止夤舛确y(cè)定抗菌肽OD595值,用該標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算抗菌肽含量。

將提取到的抗菌肽粗提液用截留分子量為3 KDa的超濾離心管濃縮,每1 g提取的抗菌肽統(tǒng)一收集并定容至5 mL容量瓶中。吸取0.1 mL抗菌肽粗提液于試管中,加入1 mL無(wú)菌水稀釋,并加入5 mL配制好的顯色劑考馬斯亮藍(lán)G-250試劑,搖勻,放置2 min后測(cè)定OD595值,以無(wú)菌水作為對(duì)照,每個(gè)處理重復(fù)三次,以測(cè)得的OD595帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計(jì)算抗菌肽含量。

2.3 抗菌肽抑菌活性測(cè)定

分別吸取3 mL培養(yǎng)活化好的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌懸浮液于裝有150 mL的溫?zé)岬腖B固體培養(yǎng)基中,搖勻,倒平板。每種菌液各倒9個(gè)平板,每個(gè)平板放置3片紙碟(直徑6 mm),其中3個(gè)平板紙碟上分別滴加8 μL被喂食Cry2Ad毒素抗Cry2Ad小菜蛾的抗菌肽溶液、抗Cry2Ad毒素品系小菜蛾的抗菌肽溶液和無(wú)菌水；3個(gè)平板紙碟上分別滴加8 μL被喂食Cry2Ad毒素抗Cry2Ad小菜蛾的抗菌肽溶液、被喂食Cry2Ad毒素的敏感品系小菜蛾的抗菌肽溶液和無(wú)菌水；3個(gè)平板中分別滴加被喂食Cry2Ad毒素抗Cry2Ad小菜蛾和敏感品系小菜蛾的抗菌肽溶液及無(wú)菌水,其中無(wú)菌水為陰性對(duì)照。每個(gè)平板倒扣在生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24 h,記錄抑菌圈直徑,用公式(1)統(tǒng)計(jì)抑菌效果。

2.4 小菜蛾抗菌肽分子量測(cè)定

2.4.1 超濾管離心分離粗提液 取分子截留量為10 KDa的15 mL超濾管,內(nèi)管加無(wú)菌水,冰上預(yù)冷5 min,外管及蓋子用無(wú)菌水沖洗3次后晾干備用；吸取抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽粗提液至超濾管內(nèi)管中,4℃下5 000 r·min-1離心30 min,吸取超濾管下層液體至滅菌處理過的0.5 mL EP離心管中,備用。

2.4.2 SDS-PAGE電泳檢測(cè)抗菌肽分子量 用SDS-PAGE電泳檢測(cè)小菜蛾抗菌肽粗提液超濾管離心分離結(jié)果(Bradley et al.,1995)。聚丙烯酰胺凝膠配置及電泳方法參見分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(薩姆布魯克,1991),稍作改動(dòng)(王立新等,2008)。蛋白質(zhì)Marker干粉用1×蛋白緩沖液150 μL充分溶解,沸水浴5 min,冷卻后分裝,每管10 μL,-20℃保存?zhèn)溆?。取抗Cry2Ad毒素抗性品系和敏感品系小菜蛾抗菌肽經(jīng)超濾管純化的下層溶液各20 μL,分別加入5×蛋白上樣緩沖液5 μL,移液槍反復(fù)吸打使其充分混勻,10 μL上樣。取分裝小管的蛋白質(zhì)Marker,室溫融化后,沸水浴5 min,20 μL上樣。

2.5 抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽分離、純化

將732型陽(yáng)離子交換干樹脂和717型陰離子交換干樹脂用飽和NaCl溶液浸泡1-2 h,用純水清洗至流出液變白后純水浸泡12-24 h。用5%NaOH溶液浸泡60-120 min,然后水洗至pH＝7.0,再用5%HCl溶液和5%NaOH溶液分別浸泡陽(yáng)離子交換樹脂和陰離子交換樹脂12-24 h,備用(李欣等,2014)。

將處理好的離子交換樹脂裝入層析柱(15 mm×400 mm)中,用pH 3.0的緩沖液(11.4 mL的0.2 mol·L-1鹽酸與50 mL的0.2 mol·L-1甘氨酸混合)平衡陽(yáng)離子交換樹脂(Hunter et al.,2001),用pH 12.0的緩沖液(11.4 mL的0.2 mol·L-1NaOH與50 mL的0.2 mol·L-1甘氨酸混合)平衡陰離子樹脂(周虎,2015)。分別加入2 mL經(jīng)截留分子量為10 KDa超濾管分離后的下層抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽溶液,用pH為12.0的0.2 mol·L-1NaOH溶液洗脫陽(yáng)離子交換柱,用pH為3.0的5%HCl溶液洗脫陰離子交換柱,形成的pH梯度范圍為3.0-12.0。洗脫流速為3 mL·min-1,每管收集3 min,用自動(dòng)部分收集器收集流出液,直到流出液的pH值為6-7。

以洗脫液作為參比液,檢測(cè)各管分離液OD280值。收集吸收值大于0.1且較為集中區(qū)域的各分離液,用截留分子量為3 KDa的超濾濃縮離心管濃縮,加100 μL無(wú)菌水轉(zhuǎn)移出超濾管上層物質(zhì),進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。

分別吸取3 mL培養(yǎng)活化好的大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌懸浮液(菌液濃度為105CFU·mL-1)于裝有150 mL的溫?zé)岬腖B固體培養(yǎng)基中,搖勻,倒平板。每個(gè)平板放置4片紙碟(直徑6 mm),分別吸取各部分收集液8 μL滴加在紙碟上,以滴加滅過菌的洗脫液為陰性對(duì)照。每個(gè)平板倒扣在生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24 h,記錄抑菌圈直徑,按公式(2)計(jì)算抑菌率,并統(tǒng)計(jì)分析各組分抑菌活性差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同品系小菜蛾抗菌肽含量差異

提取Fuzhou-S品系和抗Cry2Ad毒素的品系(Fuzhou-R2Ad)小菜蛾抗菌肽,利用考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定抗菌肽含量(表1),結(jié)果表明：抗Cry2Ad毒素的小菜蛾品系(Fuzhou-R2Ad)體內(nèi)抗菌肽含量濃度較敏感品系小菜蛾更高,并且喂食Cry2Ad毒素后,小菜蛾體內(nèi)抗菌肽都顯著增加,而抗Cry2Ad毒素的小菜蛾抗菌肽增加尤為明顯。

表1 不同處理后小菜蛾死亡率及其抗菌肽濃度1)Table 1 Mortality and antibacterial peptide concentration of P.xylostella induced by different methods

3.2 不同品系小菜蛾抗菌肽抑菌活性差異

通過比較不同誘導(dǎo)處理的Fuzhou-S品系和抗Cry2Ad毒素的品系(Fuzhou-R2Ad)小菜蛾抗菌肽含量和抑菌效果,結(jié)果表明,抗Cry2Ad毒素小菜蛾體內(nèi)抗菌肽對(duì)革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌E.coli和革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌S.aureus的抑菌效果都極顯著高于敏感品系小菜蛾(表2,圖1)。

表2 小菜蛾抗菌肽抑菌活性1)Table 2 The antimicrobial activity of antibacterial peptide from P.xylostella

圖1 不同品系小菜蛾抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性Figure 1 The antibacterial activity of antibacterial peptides from different P.xylostella strains against Straphylococcus aureus

小菜蛾被飼喂Cry2Ad毒素72 h后,抗Cry2Ad毒素小菜蛾體內(nèi)抗菌肽含量顯著提高。由此可知,Cry2Ad毒素可誘導(dǎo)小菜蛾產(chǎn)生抗菌肽,小菜蛾對(duì)Cry2Ad毒素產(chǎn)生抗性后,其體內(nèi)的抗菌肽含量和活性都表現(xiàn)出特異性,相較于敏感品系,抗菌肽含量更高,對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性更強(qiáng),初步認(rèn)為小菜蛾體內(nèi)抗菌肽與其對(duì)Cry2Ad毒素的抗性相關(guān)。

3.3 SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)抗菌肽分子量

從SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果可以看出(圖2),抗Cry2Ad毒素品系小菜蛾被檢測(cè)出含有介于3-20 KDa多肽類主要有3種,而敏感小菜蛾只檢測(cè)出有2種,抗Cry2Ad毒素品系小菜蛾含有一分子量約為7.8 KDa的肽類物質(zhì),根據(jù)抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽含量和活性表現(xiàn)的特異性,初步認(rèn)為該分子量約為7.8 KDa的多肽為抗Cry2Ad毒素小菜蛾所有的特異性抗菌肽。

圖2 SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定結(jié)果Figure 2 Test results of SDS-PAGE Gel electrophoresis

3.4 抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽分離純化結(jié)果

用732型陽(yáng)離子交換樹脂層析抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽,共收集40管洗脫液,檢測(cè)每管洗脫液的OD280值,OD280值越高,抗菌肽含量越多(Luo et al.,2013；Zlili et al.,2004),結(jié)果如圖3A所示。取OD280值較高的第5-14管分離液進(jìn)行進(jìn)一步抑菌活性測(cè)定。從抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看(表3,圖4),5-14號(hào)管各組分對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌皆有一定抑菌活性,其中第8號(hào)管收集液對(duì)大腸埃希菌的抑菌活性較高,可知該組分為活性抗菌肽成分。

圖3 離子交換層析分離小菜蛾抗菌肽效果Figure 3 Effect of chromatographic separation of antimicrobial peptide from P.xylostella on ion exchange column chromatography

表3 離子交換柱分離組分抑菌活性1)Table 3 Bacteriostatic activity of separated fractions from ion exchange column

圖4 SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定結(jié)果Figure 4 Test results of SDS-PAGE Gel electrophoresis

用717陰離子交換樹脂分離的收集液在5-10管中吸收值較大,第6管吸收值最大(圖3B),從抑菌圈試驗(yàn)結(jié)果可以看出(表3,圖4),5-10號(hào)管各組分對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌皆有一定抑菌活性,其中6、7號(hào)管組分對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌活性較好,可知該幾個(gè)組分皆為抗菌肽活性成分。

比較陽(yáng)離子和陰離子交換柱層析對(duì)抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽的分離存活效果,發(fā)現(xiàn)采用陰離子柱層析分離的各抑菌活性組分較快出柱,且較為集中,拖尾不明顯。

4 小結(jié)與討論

本研究中發(fā)現(xiàn),敏感品系小菜蛾喂食Cry2Ad毒素后,被誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗菌肽。不同的誘導(dǎo)方法可使昆蟲產(chǎn)生不同的抗菌肽,本研究中小菜蛾被喂食Cry2Ad毒素后體內(nèi)抗菌肽含量顯著提高,可知Cry2Ad毒素可誘導(dǎo)小菜蛾產(chǎn)生抗菌肽。

比較抗Cry2Ad毒素小菜蛾品系與敏感小菜蛾品系抗菌肽的含量和抑菌活性發(fā)現(xiàn),抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽的含量和抑菌活性都具有特異性,通過抗菌肽分子量測(cè)定發(fā)現(xiàn),其體內(nèi)多含有一分子量約為7.8KDa的抗菌肽?？梢哉J(rèn)為小菜蛾體內(nèi)抗菌肽的種類、含量及活性特征與小菜蛾對(duì)Cry2Ad毒素的抗性有一定的關(guān)聯(lián)。Wang等(2012)采用針刺法誘導(dǎo)小菜蛾產(chǎn)生抗菌肽,用SDS-PAGE凝膠電泳法結(jié)合質(zhì)譜測(cè)得其抗菌活性多肽分子量為4.4 KDa。黨向利等(2011)從家蠅蛹體內(nèi)分離純化出三種抗菌肽及一種抗菌化合物,表明昆蟲體內(nèi)含多種抗菌物質(zhì)共同發(fā)揮抗菌作用,其中三種抗菌肽的分子量分別約為12 KDa、8 KDa、4 KDa,本試驗(yàn)分離獲得的抗菌肽分子量范圍與其較為接近。

本試驗(yàn)中采用超濾法對(duì)小菜蛾抗菌肽粗提液進(jìn)行初步分離,利用抗菌肽帶電荷的特性,分別采用陰陽(yáng)離子交換樹脂法進(jìn)一步分離純化,可以得到較好的分離、純化效果,該方法較為簡(jiǎn)便,且損失量少。本研究結(jié)果可為今后從分子水平探討抗菌肽與小菜蛾對(duì)Cry2Ad毒素抗性的機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。抗Cry2Ad毒素小菜蛾抗菌肽的純化獲得可為進(jìn)一步研究抗菌肽蛋白結(jié)構(gòu)和基因研究提供材料,也可為從免疫系統(tǒng)調(diào)控對(duì)小菜蛾進(jìn)行治理提供理論基礎(chǔ)。