陳敏卿 龍巖市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗檢測中心 福建龍巖 364000

豬大腸桿菌病是由豬致病性大腸桿菌引起的，臨床上主要引起仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病，在我國各地均有發(fā)生，給生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失[1-3]。隨著生豬規(guī)?；B(yǎng)殖的發(fā)展及抗生素的大量使用，同時又因大腸桿菌其血清型眾多，抗原復(fù)雜，具有容易產(chǎn)生變異等特性，大腸桿菌菌株已產(chǎn)生廣泛的耐藥性和多重耐藥性。因此，本試驗通過細菌的分離鑒定，并篩選其敏感藥物，從而有效的指導(dǎo)臨床用藥，達到最佳的治療效果。

1 材 料

1.1 病料及來源 病料來源于福建省某規(guī)?；i場疑似發(fā)生大腸桿菌病的仔豬，無菌采集豬淋巴結(jié)、肝臟、脾臟、腸內(nèi)容物、腸系膜淋巴結(jié)等病料。

1.2 材料及試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基購置廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；藥敏紙片購置北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；DNA提取試劑盒、2×EasyTaq PCR Super-Mix等試劑購置全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗動物 清潔級昆明小鼠購置吳氏實驗動物中心。

2 方 法

2.1 細菌分離培養(yǎng)及鏡檢 將病料接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18～24 h，將可疑的大腸桿菌菌落接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，37℃恒溫箱中純化培養(yǎng)12～18 h。挑取單個菌落進行革蘭染色，置于顯微鏡下觀察鏡檢。

2.2 測序鑒定 選用通用引物27F/1492R擴增細菌 16S rRNA。 27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3'，1492R：5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 5 min、94 ℃變性 40 s、52 ℃復(fù)性 40 s、72 ℃延伸 1 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化和克隆，送往生工（上海）生物工程有限公司進行基因測序，將測序的結(jié)果與GenBank中公布的序列進行同源性分析。

2.3 動物致病性試驗 參照文獻方法[4]，將待檢的菌株接種營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)18 h，細菌計數(shù)后，將菌液稀釋成1010CFU/mL。10只昆明小鼠隨機分成2組，試驗組腹腔接種0.3 mL菌液，對照組腹腔注射等劑量的生理鹽水，隔離飼養(yǎng)，觀察小白鼠死亡情況。

2.4 藥敏試驗 采用K-B藥敏紙片紙法，將純化的菌落涂布于瓊脂平板上，將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)，24 h后觀察結(jié)果，并根據(jù)抑菌環(huán)直徑來判定試驗結(jié)果。

3 結(jié) 果

3.1 細菌的分離與鏡檢 經(jīng)培養(yǎng)，在普通瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)灰白色、稍隆起、圓形、濕潤、光滑、邊緣整齊的中等大小菌落（直徑2～3 mm）；在麥康凱培養(yǎng)基上長出磚紅色、光滑、濕潤、圓形隆起、邊緣整齊的菌落。革蘭染色結(jié)果為中等大小、兩端鈍圓、散在排列、無芽孢，革蘭陰性桿菌（見圖1）。

3.2 序列測定及鑒定 分離的細菌PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠瓊脂電泳，出現(xiàn)預(yù)期的特異性條帶 （見圖2）。將測序結(jié)果采用Bioedit軟件參照正反向序列圖譜對序列進行人工校對，然后輸入Genbank用Blastn軟件進行相似性比較，并與數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離的細菌與GenBank中公布的大腸桿菌16S rRNA序列同源性高達99.9%以上，確定分離的細菌為大腸桿菌。

圖1 革蘭染色結(jié)果

圖2 豬大腸桿菌16S rRNA基因PCR結(jié)果

3.3 致病性試驗結(jié)果 小鼠攻毒后24 h后，試驗組的5只小鼠全部死亡，而對照組無出現(xiàn)死亡。試驗組的發(fā)病小鼠出現(xiàn)精神沉郁、低頭昏睡、體溫升高、采食量大幅減少、腹瀉、呼吸加快。剖檢死亡小鼠可見肝臟腫大，有出血點和壞死點，心包淤血，腸道炎癥膨脹，腸腔內(nèi)充滿水樣稀便，說明本試驗分離的大腸桿菌具有一定的致病性。

3.4 藥敏試驗結(jié)果 瓊脂平板經(jīng)24 h培養(yǎng)，用直尺測量藥敏紙片的抑菌圈直徑，分析該分離菌的藥物敏感藥物（見表1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)該分離菌只對丁胺卡那和頭孢喹肟敏感，而對慶大霉素、恩諾沙星、阿莫西林、強力霉素、磺胺嘧啶鈉和林可霉素都存在不同程度的耐藥性。

4 討 論

1）豬大腸桿菌病在全世界范圍內(nèi)均有發(fā)生，在我國廣泛流行，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。病豬主要表現(xiàn)為腹瀉、漿膜性水腫等腸道癥狀，嚴重影響仔豬的健康，死亡率提高[5]。本研究通過對細菌的分離，并通過革蘭染色鏡檢、PCR擴增和克隆測序鑒定，明確了本試驗分離的細菌為豬大腸桿菌。同時，小鼠毒力實驗表明該試驗分離的豬大腸桿菌具有一定的致病性。

表1 藥物敏感試驗結(jié)果

2）目前，細菌的鑒定方法主要包括表型鑒定法和分子遺傳學(xué)鑒定法兩大類，表型鑒定法主要是對細菌形態(tài)和生理生化進行鑒定，而分子遺傳學(xué)鑒定法是核酸水平的鑒定。生理生化表型鑒定常出現(xiàn)不穩(wěn)定、敏感性不高、測試項目多、費時費力等問題。本試驗先通過表型的細菌形態(tài)學(xué)觀察初步確定細菌的種類，再通過PCR和16S rRNA序列測定，從分子遺傳學(xué)水平對分離的細菌進一步鑒定，快速、準確的從細菌的表型水平再到分子遺傳學(xué)水平對該分離菌進行了鑒定，確保了細菌鑒定的準確性。

3）豬大腸桿菌病感染后，使用敏感抗生素具有一定的效果，但大腸桿菌由于其血清型眾多，抗原復(fù)雜，又具有容易產(chǎn)生變異的特性[6]和長期使用同類抗生素會造成細菌的耐藥性，導(dǎo)致治療困難。所以臨床上有必要對發(fā)病的豬場進行分離鑒定并進行藥敏試驗，從而指導(dǎo)臨床生產(chǎn)用藥和防治。本試驗藥敏試驗表明分離的豬大腸桿菌對慶大霉素、恩諾沙星、阿莫西林、強力霉素、磺胺嘧啶鈉、林可霉素都表現(xiàn)為耐藥性，只有對丁胺卡那和頭孢喹肟敏感，說明本試驗分離的大腸桿菌株具有多重耐藥的特性，給生產(chǎn)上的治療帶來了巨大的困難。