林鋒強(qiáng) 朱小麗 陳仕龍 肖世峰 程曉霞 王 劭 陳少鶯

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 福建省畜禽疫病防治工程技術(shù)研究中心 福州 350013）

番鴨呼腸孤病毒病臨床上以軟腳為主要癥狀，以肝、脾表面有多量白點(diǎn)、腎臟腫大、出血、表面有黃色條斑為主要病理變化的傳染病[1-2]。該病在意大利、美國、德國和以色列等國家傳播，國內(nèi)福建、廣東和浙江等省份自1997年以來都有該病發(fā)生的報(bào)道，通過血清學(xué)調(diào)查表明在番鴨群中廣泛存在呼腸孤病毒感染，給番鴨養(yǎng)殖業(yè)帶了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。

番鴨呼腸孤病毒為免疫抑制性病毒，能夠感染番鴨、半番鴨和鵝等水禽[6]，感染后引起水禽免疫器官壞死或萎縮等病變，對(duì)免疫功能有抑制作用。番鴨養(yǎng)殖過程中番鴨細(xì)小病毒（MPV）病和番鴨小鵝瘟?。℅PV）是危害最大的傳染性疾病，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[7-8]。我們研制的番鴨MPV-GPV二聯(lián)弱毒疫苗是目前預(yù)防這兩種疫病的主要手段，免疫保護(hù)率可達(dá)90%以上[9]。為了探討番鴨呼腸孤病毒感染對(duì)MPV-GPV二聯(lián)弱毒疫苗免疫造成的影響，本研究從番鴨呼腸孤病毒感染對(duì)MPV-GPV二聯(lián)弱毒疫苗抗體應(yīng)答和番鴨B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的變化出發(fā)，探討MDRV感染對(duì)番鴨體液免疫應(yīng)答的影響，為有效防治該病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株和疫苗 番鴨呼腸孤病毒（MDRV MW9710株）由本室分離、鑒定并保存。MPV-GPV二聯(lián)弱毒疫苗由本實(shí)驗(yàn)室制備（批號(hào)20170520）。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 1日齡雛番鴨購自莆田廣東溫氏家禽有限公司，雛鴨未免疫任何疫苗。

1.3 主要儀器及試劑 RPMI-1640購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；LPS購自sigma公司，用RPMI-1640配成1 mg/mL，冷凍保存?zhèn)溆谩TT購自sigma公司，用RPMI-1640配成5 mg/mL，冷凍保存?zhèn)溆?。淋巴?xì)胞分離液購自上海恒信化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜（DMSO）購自上海化學(xué)試劑研究所；ELX800UV酶標(biāo)儀為Bio-tek產(chǎn)品。

1.4 試驗(yàn)分組及設(shè)計(jì) 100羽番鴨分為對(duì)照組（50羽）、MDRV(1 200，50羽）。1日齡時(shí)對(duì)照組注射0.2 mL Hank's；MDRV組感染量按1 200稀釋病毒原液后腿肌注射0.2 mL/羽（103.8TCID50/羽）。攻毒后隔離飼養(yǎng)。

1.5 病毒感染對(duì)MPV-GPV弱毒疫苗誘發(fā)抗體反應(yīng)的影響 取對(duì)照組和MDRV組各10羽，于1日齡時(shí)腿肌免疫M(jìn)PV-GPV弱毒疫苗1羽份/羽，于免疫后 7 d、14 d、21 d、28 d 采血分離血清，用 LPAI法檢測(cè)抗MPV和GPV抗體，比較試驗(yàn)組與對(duì)照組之間的差異。

1.6 淋巴細(xì)胞分離

1.6.1 番鴨外周血淋巴細(xì)胞分離 感染后第7 d、14 d、21 d和28 d將無菌心臟采集番鴨抗凝全血疊加于等量的淋巴細(xì)胞分離液上；3 000 r/min離心10 min，吸取淋巴細(xì)胞層，移入無菌離心管中；加入適量Hank's液，離心10 min，棄上清，重復(fù)洗滌3次；加入2 mL淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；6 g/L臺(tái)酚藍(lán)染色計(jì)數(shù)，用淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL。

1.6.2 脾臟和法氏囊淋巴細(xì)胞分離 感染后第7 d、14 d、21 d和28 d將無菌采集的脾臟和法氏囊分別放入已盛有Hank's液的平皿中，用滅菌剪刀、鑷子剝?nèi)ケ荒?；剪碎后，移入滅?0 mL離心管中；加入4 mL胰酶，輕輕晃動(dòng)離心管，使組織和胰酶充分混勻，37℃水浴作用30 min，每隔10 min搖勻一次；消化完畢之后，過平皿中的200目篩網(wǎng)，分別收集組織細(xì)胞懸液，3 000 r/min，離心10 min；棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液3 mL，重懸沉淀細(xì)胞，冰浴作用30 min，待紅細(xì)胞完全破碎后，3 000 r/min離心10 min，棄上清；Hank's液洗3次，加入2 mL淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，臺(tái)酚藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為 5×106個(gè)/mL。

1.7 淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng) 試驗(yàn)孔每孔加50 μL細(xì)胞懸液和 50 μL 20 μg/mL ConA， 對(duì)照孔加 50 μL細(xì)胞懸液和50 μL RMPI 1640完全培養(yǎng)基，均設(shè)3個(gè)重復(fù)，并設(shè)RMPI 1640空白孔。40℃、5%CO2培養(yǎng)60 h。培養(yǎng)結(jié)束前3 h，各孔加入10 μL MTT。培養(yǎng)結(jié)束后2 000 r/min離心10 min，傾去上清液，加入150 μL DMSO溶液反應(yīng)20 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔OD570nm值。用刺激指數(shù)（SI）評(píng)價(jià)組間差異性。SI計(jì)算方法：

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 使用Microsoft Excel軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差和方差分析，不同組別的所有數(shù)據(jù)用t檢驗(yàn)確定差異顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 MDRV感染對(duì)番鴨GPV抗體應(yīng)答的影響由圖1可以看出：1日齡番鴨免疫M(jìn)PV-GPV二聯(lián)疫苗后，IM 7 d時(shí)所有番鴨GPV-LPAI效價(jià)均為陽性，達(dá)3log2以上。隨后持續(xù)上升，到IM 21 d后效價(jià)可達(dá)6log2以上，可持續(xù)到IM 28 d。 而1日齡番鴨感染MDRV后免疫M(jìn)PV-GPV二聯(lián)疫苗，IM 7 d時(shí)番鴨GPV-LPAI效價(jià)平均值1.5log2；隨后緩慢上升，到IM 21-28 d時(shí)GPV-LPAI效價(jià)平均值維持在約3log2。與單獨(dú)免疫組相比，GPV-LPAI效價(jià)大大降低，不能提供有效保護(hù)。說明MDRV感染嚴(yán)重干擾了番鴨小鵝瘟疫苗的抗體免疫應(yīng)答，使番鴨對(duì)番鴨小鵝瘟病毒的易感性增強(qiáng)。

圖1 MDRV感染對(duì)番鴨GPV抗體免疫應(yīng)答的影響

2.2 MDRV感染對(duì)番鴨MPV抗體應(yīng)答的影響由圖2可以看出：1日齡番鴨免疫M(jìn)PV-GPV二聯(lián)疫苗后，IM 7 d時(shí)所有番鴨GPV-LPAI效價(jià)均為陽性，達(dá)3log2以上。隨后持續(xù)上升，到IM 21 d后效價(jià)可達(dá)6log2以上，可持續(xù)到IM 28 d。而1日齡番鴨感染MDRV后免疫M(jìn)PV-GPV二聯(lián)疫苗，IM 7 d時(shí)番鴨GPV-LPAI效價(jià)平均值1.5log2；隨后緩慢上升，到IM 21-28 d時(shí)GPV-LPAI效價(jià)平均值維持在約3log2。與單獨(dú)免疫組相比，GPV-LPAI效價(jià)大大降低，不能提供有效保護(hù)。說明MDRV感染嚴(yán)重干擾了番鴨MPV的抗體免疫應(yīng)答，使番鴨對(duì)番鴨MPV的易感性增強(qiáng)。

圖2 MDRV感染對(duì)番鴨MPV抗體應(yīng)答的影響

2.3 番鴨外周血液B淋巴細(xì)胞增殖功能的變化1日齡番鴨人工感染MDRV后，PI 7 d外周血T淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)與對(duì)照組相比，差異顯著（P<0.05）。PI 14-28 d與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01）。表明MDRV感染抑制了外周血B淋巴細(xì)胞增殖功能。

表1 番鴨外周血B淋巴細(xì)胞增殖功能的變化（x±s，n=5）

2.4 番鴨法氏囊B淋巴細(xì)胞增殖功能的變化1日齡番鴨人工感染MDRV后，PI 7 d外周血T淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)與對(duì)照組相比，差異顯著（P<0.05）。PI 14-28 d與對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01）。表明MDRV感染抑制了法氏囊B淋巴細(xì)胞增殖功能。

表2 番鴨胸腺B細(xì)胞增殖功能的變化（x±s，n=5）

2.5 番鴨脾臟B淋巴細(xì)胞增殖功能的變化 1日齡番鴨人工感染MDRV后，PI 7 d外周血T淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)與對(duì)照組相比，差異顯著（P<0.05）。PI 14-28 d與對(duì)照組相比差異極顯著 （P<0.01）。表明MDRV感染抑制了脾臟B淋巴細(xì)胞增殖功能。

表3 番鴨脾臟B淋巴細(xì)胞增殖功能的變化（x±s，n=5）

3 討 論

體液免疫應(yīng)答由B細(xì)胞介導(dǎo)，B細(xì)胞分化過程可分為2個(gè)階段，即抗原非依賴期和抗原依賴期。在抗原非依賴期，B細(xì)胞分化與抗原刺激無關(guān)，主要在中樞免疫器官內(nèi)進(jìn)行，法氏囊是禽類體液免疫中樞器官，是產(chǎn)生成熟B淋巴細(xì)胞的基礎(chǔ)；而抗原依賴期是指成熟B細(xì)胞受抗原刺激后，繼續(xù)分化為合成和分泌抗體的漿細(xì)胞階段，這個(gè)階段主要在外周免疫器官內(nèi)進(jìn)行包括了對(duì)抗原的識(shí)別、活化、增殖等過程[10]。法氏囊和脾臟損傷、B淋巴細(xì)胞數(shù)量減少及其增殖功能降低，嚴(yán)重影響了機(jī)體的體液免疫應(yīng)答和免疫機(jī)能[11-12]。

近年來流行病學(xué)調(diào)查表明MDRV在我國番鴨飼養(yǎng)過程中普遍存在，番鴨常發(fā)生其他細(xì)菌或病毒的繼發(fā)感染或并發(fā)感染，產(chǎn)生的原因是番鴨呼腸孤病毒導(dǎo)致番鴨免疫功能下降[13-14]。王全溪等研究發(fā)現(xiàn)，MDRV感染脾漿細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞在感染過程中明顯減少，導(dǎo)致機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫受到嚴(yán)重破壞[15]。陳志勝等研究表明雛番鴨呼腸孤病毒對(duì)雛鴨免疫器官的細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用。揭示該病毒致病機(jī)理與淋巴細(xì)胞凋亡從而引起的免疫抑制相關(guān)[16]。盧玉葵等檢測(cè)免疫組織TANAE+、漿細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量的變化發(fā)現(xiàn)感染MDRV后番鴨免疫器官T細(xì)胞、漿細(xì)胞明顯減少[17]。

本研究認(rèn)為番鴨呼腸孤病毒感染嚴(yán)重干擾了番鴨MPV-GPV二聯(lián)弱毒疫苗的抗體應(yīng)答，使番鴨在易感日齡抗體效價(jià)大大降低，處于易感狀態(tài)。MDRV感染導(dǎo)致MDGPV活疫苗免疫抗體效價(jià)不合格 （判定標(biāo)準(zhǔn)為14日齡免疫番鴨MDGPV LPAI抗體效價(jià)大于3log2），造成免疫失敗。可能的原因是由于MDRV感染抑制IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子生成，使B細(xì)胞增殖和分泌抗體能力減弱，抗體免疫應(yīng)答水平下降，導(dǎo)致番鴨對(duì)MDGPV感染更加易感，危害性大大加強(qiáng)。MDRV感染后外周血B淋巴細(xì)胞增殖能力下降，抑制IL-2和IFN-γ生成。從細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)功能來看，IL-2能夠促進(jìn)B細(xì)胞增殖和分泌抗體，IFN-γ能夠促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化。這兩種細(xì)胞因子抑制生成與導(dǎo)致體液免疫應(yīng)答水平顯著下降有一定的相關(guān)性。

因此，建議臨床上要重視對(duì)番鴨呼腸孤病毒病的免疫，降低因MDRV免疫抑制導(dǎo)致的其他病毒感染（如番鴨三周病或小鵝瘟等）的危害性增強(qiáng)，減少經(jīng)濟(jì)損失。