王曉舟，王宇，張振中，姚瑞芹

(1徐州醫(yī)科大學(xué)機(jī)能學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，徐州 221004;2徐州醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心)

腦白質(zhì)損傷(WMI)是早產(chǎn)兒特有的腦損傷形式之一，WMI的病理特點(diǎn)主要包括反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞活化、少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPCs)損傷導(dǎo)致的髓鞘形成障礙和軸突病變等，多數(shù)WMI患兒會(huì)表現(xiàn)出感覺、運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能等障礙[1, 2]。目前臨床尚無WMI的有效根治措施。胎兒腦組織少突膠質(zhì)細(xì)胞系以O(shè)PCs為主，人孕23～32周時(shí)胎兒腦組織OPCs對(duì)缺氧條件最敏感，缺氧可導(dǎo)致OPCs損傷，使少突膠質(zhì)細(xì)胞分化成熟障礙，最終導(dǎo)致WMI[3]。OPCs標(biāo)記物神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞抗原2(NG2)，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)可用于顯示缺氧損傷后OPCs和星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目變化情況。目前國(guó)內(nèi)外通常采用新生鼠缺氧缺血(hypoxia-ischemia，HI)的方法來制作WMI動(dòng)物模型，從而進(jìn)一步研究WMI的發(fā)病機(jī)制及相應(yīng)治療措施[4～7]。6%、8%氧氣濃度均能成功建立缺血缺氧WMI模型，但兩者造成的腦組織損傷程度及具體作用機(jī)制目前尚不清楚。2014年3月～2016年4月，我們觀察了缺氧新生大鼠胼胝體NG2、GFAP的表達(dá)變化，旨在為WMI的發(fā)病機(jī)制研究提供相關(guān)理論支持。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑 新生3 d Sprague-Dawley(SD)大鼠36只及其母鼠，SPF級(jí)，雌雄不限，由徐州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)和使用許可證號(hào)碼分別為SCXK(蘇)2005-0005和SYXK(蘇)2005-0018。兔抗神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞抗原2(neuron-glial antigen 2，NG2)抗體購(gòu)自 Millipore公司，雞抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體購(gòu)自 Novus Biologicals公司，山羊抗兔IgG/FITC熒光二抗購(gòu)自Santa Cruz公司，驢抗雞IgG/TRITC熒光二抗購(gòu)自Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 動(dòng)物分組及HI損傷模型制作方法 取 SD大鼠36只，隨機(jī)分為對(duì)照組、低濃度組(6%氧)、高濃度組(8%氧)各12只。對(duì)照組新生鼠不做任何處理。低、高濃度組制作HI損傷模型：大鼠吸入乙醚吸入麻醉，仰臥位固定四肢、頭部，消毒頸部皮膚，無菌條件下作頸部正中約0.5 cm切口；逐層分離皮下組織，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(氧損傷側(cè))后結(jié)扎，縫合皮膚；術(shù)后待大鼠麻醉清醒后放回母鼠籠中，恢復(fù)2 h；取兩組新生鼠，置于ZKY-4F智能控氧儀缺氧倉(cāng)(杭州艾普儀器設(shè)備有限公司)，缺氧倉(cāng)置于37 ℃恒溫水浴箱，低、高濃度組分別用6%、8%氧氣濃度混合氮合氣，2 L/min持續(xù)灌注2 h。造模成功后將兩組新生鼠放回母鼠身邊常規(guī)喂養(yǎng)。

1.3 腦組織切片制備及NG2、GFAP檢測(cè)方法 采用免疫熒光染色法。分別于造模2、3、4周時(shí)各組取4只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉后，用溫生理鹽水及預(yù)冷的4%多聚甲醛行心臟灌流術(shù)進(jìn)行腦組織固定，待大鼠四肢和尾部僵直、肝臟變白變硬后停止灌注。斷頭取腦，鼠腦冠狀位分別切大鼠氧損傷側(cè)及對(duì)照側(cè)組織，置于4%多聚甲醛4 ℃后固定12 h。20%、30%梯度蔗糖脫水，OCT(日本櫻花)包埋，連續(xù)切20 μm片，-80 ℃?zhèn)溆?。選取切片用0.01 mol/L PBS沖洗3次，每次5 min。加入含有5% BSA、0.3% Triton X-100的PBS 37 ℃封閉40 min。分別滴加抗NG2(1∶1 000)和GFAP(1∶1 000)抗體， 4 ℃孵育過夜；PBS充分洗滌后加相應(yīng)的二抗(1∶200)，室溫孵育1.5 h，DAPI染核5 min。每只大鼠選取3張切片，每組共選取12張切片，熒光顯微鏡下觀察拍照,使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)數(shù)200倍顯微鏡下胼胝體部位免疫熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.4 各組大鼠存活情況觀察 造模4周時(shí)觀察各組大鼠存活情況(不包括手術(shù)過程中死亡新生鼠)。

2 結(jié)果

造模2、3、4周時(shí)各組氧損傷側(cè)及氧損傷對(duì)照側(cè)腦組織NG2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較見表1、圖1。

表1 造模2、3、4周時(shí)各組氧損傷側(cè)及氧損傷對(duì)照側(cè)腦組織NG2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)

注：與氧損傷對(duì)照側(cè)比較，*P<0.05；與低濃度組氧損傷側(cè)比較，#P<0.05。

造模2、3、4周時(shí)各組氧損傷側(cè)及氧損傷對(duì)照側(cè)腦組織胼胝體GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較見表2、圖2。

造模4周時(shí)，低濃度組、高濃度組、對(duì)照組大鼠分別存活9、10、12只。與低濃度組比較，對(duì)照組、高濃度組大鼠存活數(shù)目多。

圖1 造模2、3、4周時(shí)各組氧損傷側(cè)及氧損傷對(duì)照側(cè)腦組織NG2表達(dá)

組別 GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)造模2周造模3周造模4周 低濃度組 氧損傷側(cè)499.1±18.7256.0±19.5212.9±26.3 氧損傷對(duì)照側(cè)792.7±14.4*500.7±20.7*405.3±25.2*高濃度組 氧損傷側(cè)353.1±9.1217.1±19.4206.7±24.8 氧損傷對(duì)照側(cè)597.9±13.6*#404.9±23.0*#375.2±23.7*

注：與氧損傷對(duì)照側(cè)相比，*P<0.05；與低濃度組氧損傷側(cè)相比，#P<0.05。

圖2 造模2、3、4周時(shí)各組氧損傷側(cè)及氧損傷對(duì)照側(cè)腦組織GFAP表達(dá)

3 討論

迄今為止，新生兒腦白質(zhì)損傷疾病尚無有效的治療方法，主要原因在于損傷的機(jī)制不清。因此，需要一個(gè)能夠準(zhǔn)確模擬該疾病發(fā)生發(fā)展過程的動(dòng)物模型來闡明腦白質(zhì)損傷的機(jī)制，進(jìn)而為新生兒腦白質(zhì)疾病治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究[4, 7]表明，新生大鼠缺血缺氧誘導(dǎo)的腦白質(zhì)損傷模型制作簡(jiǎn)單、方便，能較好模擬臨床新生兒腦白質(zhì)損傷，是研究和治療腦白質(zhì)損傷疾病的理想動(dòng)物模型。6%氧損傷和8%氧損傷都能成功建立缺血缺氧腦白質(zhì)損傷模型，但兩者具體損傷區(qū)別和機(jī)制還不清楚，新生3 d的SD大鼠6%和8%氧損傷哪個(gè)更適合制作研究和治療腦白質(zhì)損傷疾病的大鼠動(dòng)物模型，目前亦未見詳細(xì)有報(bào)道。

新生兒缺氧缺血性腦白質(zhì)損傷是造成慢性神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的主要原因。OPCs作為未成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞，可在體內(nèi)增殖、遷移、分化、成熟，形成髓鞘發(fā)揮作用[8～10]，但也有研究[11]表明，OPCs極易受到HI損傷的影響，在缺血后的24和48 h，OPCs的數(shù)量有短暫性減少，其大小和形態(tài)轉(zhuǎn)向更未成熟的形式，并且發(fā)現(xiàn)OPCs可能出現(xiàn)了遷移。另有研究[12]表明，HI損傷后14 d損傷半球有增殖細(xì)胞大量的存在，在損傷后21～35 d，胼胝體產(chǎn)生的少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量是對(duì)照組4倍，而損傷后35 d，少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等大量表達(dá)于損傷側(cè)胼胝體區(qū)。這表明在HI損傷后初期OPCs受到急性損傷，之后HI損傷信號(hào)可能迫使SVZ區(qū)或胼胝體區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的增殖，補(bǔ)充受損的OPCs，因此造成損傷側(cè)NG2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)急劇增加，所以HI損傷后2周時(shí)NG2(OPCs標(biāo)記物)陽(yáng)性細(xì)胞大量表達(dá)。6%氧損傷組較8%氧損傷組損傷嚴(yán)重，可能是由于受局部不利微環(huán)境的影響，受到損傷的OPCs相對(duì)較多，所以損傷后2周時(shí)OPCs的數(shù)目較8%少。而造模3周和4周時(shí)，8%氧損傷組損傷程度較低，相對(duì)于6%氧損傷組有更多OPCs分化成了少突膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致OPCs減少，故在OPCs數(shù)量上6%氧損傷組與8%氧損傷組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示，6%氧損傷組OPCs的減少可能是由于受到嚴(yán)重?fù)p失后微環(huán)境內(nèi)平衡失調(diào)，導(dǎo)致OPCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的效率降低，致使髓鞘發(fā)育受阻，而8%氧損傷組OPCs的減少是因?yàn)閾p傷較輕，更多的OPCs可以向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，OPCs數(shù)量同樣減少，所以結(jié)果顯示6%氧損傷組損傷側(cè)NG2的表達(dá)量?jī)H在2周顯著低于8%氧損傷組，而造模3周、4周時(shí)兩組均無顯著性差異。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理?yè)p傷后髓鞘再生的一個(gè)重要因素，其主要作用于細(xì)胞外的基質(zhì)，神經(jīng)系統(tǒng)損傷后它們會(huì)被激活并形成膠質(zhì)瘢痕，但過度的瘢痕組織形成對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)修復(fù)和再生起到抑制作用[13～16]。本研究檢測(cè)到星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP在HI損傷后2周時(shí)大量表達(dá)，并且這種現(xiàn)象持續(xù)到損傷后第3周和第4周。 6%氧損傷組損傷側(cè)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在2周和3周時(shí)顯著高于8%氧損傷組損傷側(cè)，4周時(shí)兩組無顯著性差異。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，HI損傷后2周至4周，大鼠損傷側(cè)胼胝體星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，2周增殖最顯著，且6%氧損傷組較8%氧損傷組促星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖更加顯著，激活星形膠質(zhì)細(xì)胞可能會(huì)抑制OPCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，以及阻礙髓鞘的形成。

本研究使用新生3 d SD大鼠建立缺血缺氧模型，對(duì)其右側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎，并分別給予6%氧和8%氧2 h造成缺氧損傷。實(shí)驗(yàn)亦觀察了不同缺氧模擬WMI 4周后大鼠的存活率，8%氧損傷組存活率與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但6%氧損傷組存活率顯著低于對(duì)照組，提示過度缺氧可能會(huì)對(duì)造模動(dòng)物造成更為嚴(yán)重的損傷，從而致死。新生3 d大鼠6%或8%氧損傷可誘使OPCs表達(dá)，但同時(shí)6%氧損傷較8%氧損傷會(huì)大量促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖，可能導(dǎo)致OPCs向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的過度抑制，從而造成腦白質(zhì)損傷加重，導(dǎo)致6%氧損傷組大鼠模型存活率明顯減低，因此，我們認(rèn)為8%氧損傷更適合建立SD大鼠HI模型。

綜上所述，缺氧可導(dǎo)致新生大鼠胼胝體NG2 、GFAP表達(dá)升高。6%、8%氧濃度均可導(dǎo)致新生大鼠胼胝體NG2 、GFAP表達(dá)升高，且8%氧濃度作用更強(qiáng)。