孫大宇，單德紅，劉旭東，劉文俊，王德山

(遼寧中醫(yī)藥大學生理教研室，沈陽110847)

中醫(yī)藏象理論認為，“脾藏意，在志為思”。脾與人的思維、情感、記憶、行為等有著密切的聯(lián)系。脾主運化，化生營氣，以營養(yǎng)意?！鹅`樞·本神》曰：“脾藏營，營舍意”。只有脾氣旺盛，營血充盛，人體才能進行思維、學習、記憶、情感等行為活動。脾虛患者易出現(xiàn)健忘、注意力不集中、思維不敏捷及智力下降等癥狀，說明脾與精神活動及行為發(fā)生有關(guān)。海馬組織與學習、空間記憶等行為密切相關(guān)。海馬組織相關(guān)神經(jīng)元細胞功能異常、凋亡的發(fā)生，可引起機體行為和運動功能的改變。同時阿片肽類多種因子可通過與海馬組織神經(jīng)元細胞表面豐富表達的受體結(jié)合，進而對神經(jīng)元細胞的功能及活性調(diào)節(jié)，最終引起機體行為的改變。高表達β內(nèi)啡肽(β-EP)可使海馬組織神經(jīng)元細胞功能下降、產(chǎn)生中樞性抑制作用的根源。蛋白激酶A(PKA)是依賴環(huán)磷酸腺苷(cAMP)的蛋白激酶，是細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的重要一員。因此，作為脾陽虛證主癥的“神疲、乏力”的發(fā)生，可能與海馬組織中樞性抑制作用有關(guān)，但其具體發(fā)生機制不明確。2016年9月～2017年8月，我們觀察了附子理中丸灌胃的脾陽虛證模型大鼠海馬組織β-EP、cAMP、PKA及神經(jīng)元細胞μ受體表達變化，并分析其可能作用機制?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 動物分組 SPF級SD雄性大鼠40只，7～8周齡，體質(zhì)量(220±10)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按體質(zhì)量分層后,采用隨機數(shù)字法分為4組：空白對照組(空白組)、脾陽虛模型組(模型組)、附子理中丸治療組(中藥組)、脾陽虛自然恢復(fù)組(自愈組)，每組10只。

1.2 脾陽虛證模型模型制備及附子理中丸給藥方法 模型組、中藥組、自愈組采用飲食失節(jié)+勞倦等復(fù)合因素方法，即飽食1日，禁食2日，每日游泳至力竭，連續(xù)2周，制備脾氣虛模型，在此基礎(chǔ)上應(yīng)用“苦寒瀉下”法，通過連續(xù)灌服100%番瀉葉，1 mL/100 g,2次/d，連續(xù)2周，制備脾陽虛模型。在模型建立后，中藥組給予附子理中丸1:1水溶液灌胃，給藥量為2 mL/(100 g·d)，1次/d，給藥2周?？瞻捉M不施加任何干預(yù)因素。模型評價標準[1，2]采用主癥+次癥法，具體如下：主癥為神疲，乏力,體溫下降，便溏，不欲飲；次癥為食少，毛色枯槁無華；評價標準為3項主癥+1項次癥或2項主癥+2項次癥為動物模型復(fù)制成功，不符合上述評價標準實驗動物予以剔除。

1.3 大鼠行為運動功能觀察

1.3.1 大鼠行為學觀察 采用曠場實驗檢測各組大鼠行為學改變，評價其中樞性疲勞，即神疲。實驗時將大鼠放入箱體底面中心，實時攝像5 min，觀察大鼠水平運動距離、直立次數(shù)。重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2 大鼠前肢抓力測定 分別于第2、4周末，采用YLS-13A大小鼠抓力測定儀檢測各組大鼠前肢抓力，評價軀體疲勞，即乏力，由專人操作以降低誤差。實驗時，抓持大鼠輕拿輕放，避免激怒，右手將大鼠抓住后按放在抓力板上，左手向前推住抓力板，然后右手向后滑至鼠尾部，左手輕輕松開抓力板，抓力板隨右手拉鼠尾的力量向前滑行，等動物用力抓住抓力板時及時 加力后拉，以得到動物的最大抓力。每只大鼠連續(xù)檢測3次，取平均值。

1.4 大鼠海馬組織β-EP、cAMP、PKA及神經(jīng)元細胞μ受體表達檢測

1.4.1 大鼠海馬組織β-EP、cAMP、PKA檢測 分別于第2、4周，5%水合氯醛0.5 mL/100 g麻醉大鼠，斷頭分離腦組織，鈍性剝離海馬組織，左側(cè)海馬組織置于無菌低溫冷凍管中，-80 ℃保存；右側(cè)海馬組織置于4%多聚甲醛溶液中固定，常溫保存。采用ELISA法：取海馬組織，1∶1加入4 ℃生理鹽水，冰上研磨2 min，低溫高速離心機10 000轉(zhuǎn)/分，離心10 min，取上清液。大鼠cAMP ELISA Kit試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)開發(fā)有限公司，編號：CSB-E07298r)；大鼠β-EP ELISA Kit試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)開發(fā)有限公司，編號：CSB-E08206r)；大鼠 PKA ELISA Kit試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，編號：D730517-0096]，所有操作均嚴格按照按照試劑盒說明書操作。應(yīng)用 Bio-Rad美國伯樂iMark酶標儀檢測海馬組織β-EP、cAMP、PKA。實驗重復(fù)3 次，取平均值。

1.4.2 大鼠海馬組織神經(jīng)元細胞 μ受體檢測 采用免疫組化SABC法。4%多聚甲醛固定海馬組織，常規(guī)石蠟包埋切片，PBS 沖洗3次×5 min；室溫正常山羊血清封閉20 min；滴加兔抗大鼠μ抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，編號：bs-1195R)，4 ℃過夜，PBS 沖洗3次×5 min；滴加生物素標記羊抗兔IgM抗體，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次×5 min；加入SABC 試劑，37 ℃孵育30 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。陰性對照采用抗體稀釋液代替一抗，步驟同上。利用 BI-2000系統(tǒng)，在光鏡下(10×20倍)選取相同部位相同視野照相分析，計算每個視野陽性染色的平均光密度OD值。陽性表達神經(jīng)元細胞表現(xiàn)為細胞膜呈現(xiàn)褐色或深棕色顆粒附著，平均光密度增強。重復(fù)3 次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 大鼠水平運動距離、直立次數(shù)比較 各組大鼠水平運動距離、直立次數(shù)比較見表1 。

2.2 大鼠前肢抓力比較 中藥組、自愈組、模型組、空白組大鼠前肢抓力分別為(1 686.27±180.20)、(1 582.33±180.74)、(1 225.61±122.90)、(1 551.53±158.68)g，與空白組比較，模型組大鼠前肢抓力下降(P<0.01)；與模型組比較，中藥組和自愈組大鼠前肢抓力增強(P均<0.01)。

表1 各組大鼠水平運動距離、直立次數(shù)比較

注：與空白組比較，*P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01；與中藥組比較，#P<0.01。

2.3 大鼠海馬組織β-EP、cAMP、PKA含量比較 各組大鼠海馬組織β-EP、cAMP、PKA含量比較見表2。

表2 各組大鼠海馬組織β-EP、cAMP、PKA含量比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05；與中藥組比較，#P<0.05 。

2.4 大鼠海馬組織神經(jīng)元細胞μ受體光密度比較 中藥組、自愈組、模型組、空白組大鼠μ受體光密度分別為62.96±10.20、78.18±6.14、83.78±7.44、58.38±8.02。與空白組比較，模型組、自愈組大鼠海馬組織μ受體光密度升高(P均<0.05)；與模型組比較，中藥組大鼠海馬組織中神經(jīng)元細胞μ受體光密度降低(P<0.05)；與自愈組比較，中藥組大鼠海馬組織中神經(jīng)元細胞μ受體光密度降低(P<0.05)。

3 討論

中醫(yī)學認為脾陽虛證多由脾氣虛證基礎(chǔ)上，寒邪傷及脾陽所致，其表現(xiàn)為在脾氣虛所致食少納呆、腹脹腹瀉、神疲乏力等癥狀基礎(chǔ)上，出現(xiàn)形寒肢冷、四肢不溫、大便稀溏、腹痛綿綿等臨床癥狀。中醫(yī)藏象理論認為，“脾在體合肉，主四肢”。脾之與肉，在生理上，脾運化水谷，化生氣血，以充養(yǎng)肌肉，肌肉健壯而有力?！端貑枴り庩枒?yīng)象大論》曰：“脾生肉”，《素問·平人氣象論》亦曰：“脾藏肌肉之氣”等，都說明了肌肉賴以脾化生的氣血充養(yǎng)。若脾失健運，氣血乏源，濡養(yǎng)不足以致肌肉痿軟，四肢倦怠無力。故有《難經(jīng)·十六難》關(guān)于“怠墮嗜臥，四肢不收，有是者，脾也”的論述?！捌⒉匾?，在志為思”。脾與人的思維、情感、記憶、行為等有著密切的聯(lián)系。脾主運化，化生營氣，以營養(yǎng)意?！鹅`樞·本神》曰：“脾藏營，營舍意”。只有脾氣旺盛，營血充盛，人體才能進行思維、學習、記憶、情感等行為活動。臨床上脾虛患者易出現(xiàn)健忘、注意力不集中、思維不敏捷及智力下降的表現(xiàn)，就體現(xiàn)了脾與精神活動和行為發(fā)生的密切關(guān)系。附子理中丸(湯)是中醫(yī)“溫中健脾”法治療脾陽虛證的經(jīng)典方劑，由張仲景所著《傷寒論》中“理中湯(丸)”(人參、干姜、炙甘草、白術(shù))加附子而成。該方溫中祛寒，補氣健脾，治脾胃虛寒證，自利不渴，嘔吐腹痛，腹?jié)M不食及中寒霍亂，陽虛失血，胸痞虛證，胸痛徹背，倦怠少氣，四肢不溫。

cAMP-PKA信號通路是經(jīng)典的G蛋白耦聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可將細胞外激素、神經(jīng)肽類物質(zhì)的生物分子信號傳遞至細胞內(nèi)，引發(fā)生相應(yīng)的物學效應(yīng)。首先激素及神經(jīng)肽類物質(zhì)與受體結(jié)合，活化G蛋白偶聯(lián)受體(Gi或Gs)將信號首先傳至腺苷酸環(huán)化酶(AC)，由它控制cAMP的含量，cAMP決定蛋白激酶A(PKA)的活性，PKA負責很多蛋白的磷酸化，比如受體，離子通道，轉(zhuǎn)錄因子等等，由此調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的生物活性反應(yīng)和平衡。

β-EP是重要的腦腸肽之一，主要依賴于與分布在中樞及外周組織中的阿片受體結(jié)合發(fā)揮生物學作用。目前研究[3]發(fā)現(xiàn)其主要受體有μ、κ、δ等，其生物學功能參與體內(nèi)神經(jīng)、精神、內(nèi)分泌、消化、呼吸、心血管、睡眠、覺醒以及學習、記憶的調(diào)節(jié),保持各項功能活動的平衡。β-EP在局部組織中大量蓄積可通過與受體結(jié)合抑制cAMP-PKA信號通路的活性，進而引發(fā)細胞功能的抑制。同時PKA活性的降低可引起細胞內(nèi)相應(yīng)底物的磷酸化活性而引發(fā)生物學效應(yīng)。禁食和過度運動能夠誘發(fā)β-EP的過度釋放[4～7]。同時，“飲食失節(jié)”和“疲勞”是脾虛證的重要致病因素。呂琳等[8]研究發(fā)現(xiàn)，脾虛大鼠胃、腸組織中的β-EP含量明顯高于同期對照組，而垂體、下丘腦和血漿中的β-EP含量明顯低于同期對照組，認為β-EP的紊亂是脾虛證微觀病變特征之一。譚靜等[9]研究發(fā)現(xiàn)，脾虛大鼠血漿β-EP和胃動素(MTL)含量較對照組大鼠顯著降低，而生長抑素(SS)含量則升高，提示脾虛癥可能與β-EP分泌和代謝功能紊亂有關(guān)。脾虛證中β-EP及其受體在血清、海馬、下丘腦、胃腸道表達異常，提示“脾失健運”狀態(tài)下，β-EP對神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用異常，但其細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機制尚不明確[10，11]。

本實驗研究結(jié)果表明，模型組大鼠海馬組織β-EP及其受體高表達，這一細胞外信號的激活，通過G蛋白耦聯(lián)受體傳導(dǎo)至細胞內(nèi)，引起細胞cAMP含量降低，導(dǎo)致PKA合成減少，磷酸化活性下降。β-EP能夠直接激活細胞膜K+通道，引起K+外流，使神經(jīng)元細胞超極化，降低神經(jīng)元興奮性，同時抑制細胞內(nèi)cAMP的合成，降低其生物活性，進一步抑制神經(jīng)元細胞的活性[12]。亦可以影響Na+-K+-ATP酶活性，使Ca2+大量內(nèi)流，使細胞膜穩(wěn)態(tài)破壞和超微結(jié)構(gòu)損傷，引發(fā)細胞凋亡[13]。由此我們推測海馬組織中β-EP含量和受體的高表達，引發(fā)了細胞內(nèi)cAMP-PKA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性下調(diào)，導(dǎo)致神經(jīng)元功能的抑制，進而引起模型組大鼠出現(xiàn)中樞性神疲乏力、食少納呆的宏觀表征改變。同時，附子理中丸能夠降低因造模因素施加所導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的β-EP過度釋放和μ受體高表達變化，改善cAMP-PKA信號通路的活性變化，逆轉(zhuǎn)β-EP對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制作用。

綜上所述， 附子理中丸可改善脾陽虛證模型大鼠的脾陽虛證“神疲、乏力”等生物學行為，其機制可能為促進海馬組織β-EP含量降低、cAMP及PKA含量升高、神經(jīng)元細胞μ受體表達增加。