張春軍 董凱 董琦 宋潔 曾海 楊國宏

【摘要】 目的：探討金福菇多糖對衰老大鼠p16基因表達(dá)的影響。方法：實(shí)驗(yàn)材料選用清潔級SD大鼠25只，將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分成5組，每組5只。分別為正常對照組、衰老模型組、高劑量治療組、中劑量治療組、低劑量治療組，采用皮下注射D-半乳糖方法建立衰老大鼠模型，除正常對照組外，分別給予金福菇多糖溶液灌胃治療，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）檢測各組大鼠心臟組織p16 mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果：衰老模型組小鼠p16基因表達(dá)明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），給予金福菇多糖治療后p16基因相對表達(dá)均明顯低于衰老模型組小鼠，其中中劑量組最低，三組比較差無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：金福菇多糖可有效降低p16 mRNA的表達(dá)，從而起到抗衰老的作用，值得進(jìn)一步研究。

【關(guān)鍵詞】 金福菇多糖； 衰老； p16

【Abstract】 Objective：To explore the effect of Jin Fu Mushroom Polysaccharide on p16s gene expression of aging rats.Method：A total of 25 clean grade SD rats were chosen，the animals were randomly divided into 5 groups，5 rats in each group（the normal control group，aging model group，high-dose treatment group，middle-dose group，small-dose treatment group），using the method of subcutaneous injection of D-galactose aging rat model was established，in addition to the normal control group，another groups were given different doses of Jin Fu Mushroom Polysaccharide treatment，the p16 gene expression of rats was detected by reverse transcription PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）.Result：The p16 gene expression of aging model group was obviously higher than that of the normal control group，the difference was statistically significant（P<0.05），after giving Jin Fu mushroom polysaccharide，the p16s gene expression was lower than those of in aging model group，in which the lowest dose group，but there was no significant difference among three groups（P>0.05）.Conclusion：Jin Fu Mushroom Polysaccharide can effectively reduce the p16 mRNA expression，is likely to be the mechanism of heart in the rat model of aging，is worth of further study.

【Key words】 Jin Fu Mushroom Polysaccharide； Aging； p16

First-authors address：Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.24.005

隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們對食用菌多糖及其衍生物的活性有了更深入的了解，發(fā)現(xiàn)食用菌多糖具有一定的輔助醫(yī)療作用，如抗菌、抗病毒、抵抗缺氧環(huán)境、抗衰老、抗腫瘤、降血脂等，是保健性食品及抑癌藥物的重要原料來源[1-3]，被專業(yè)人士所認(rèn)可。近年來，國內(nèi)外關(guān)于食用菌研究很多，但多局限于食用菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其生物學(xué)特性[4-5]，

而關(guān)于金福菇多糖抗衰老的研究較少。衰老與基因有密切關(guān)系，被某些基因所控制，隨著年齡的增加，多數(shù)原癌基因表達(dá)或活性降低，使得機(jī)體組織和器官發(fā)生漸進(jìn)性退行性變，直到死亡，這是所有生物的特征[6]。細(xì)胞衰老是器官功能乃至整個機(jī)體功能衰老的主要表現(xiàn)[7]。p16基因是一種抑癌基因，在細(xì)胞衰老過程中起著重要的作用[8]。研究表明p16基因作用誘導(dǎo)細(xì)胞老化，抑制細(xì)胞無限分裂，從而維持細(xì)胞周期穩(wěn)態(tài)[9-10]，金福菇是一種分布于熱帶和亞熱帶的食用菌，具有豐富營養(yǎng)價值，且具有多種生物活性，近年來，多個課題組成員對金福菇多糖及生物活性進(jìn)行研究，金福茹多糖具有很好的抗氧化活性[11-12]。金福菇多糖具有抗氧化活性、抗腫瘤、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫等作用[13]。本實(shí)驗(yàn)探討金福菇多糖對衰老大鼠p16基因表達(dá)的影響，從而能夠抑制大鼠衰老的作用，旨在對金福菇多糖抗衰老的生物學(xué)活性進(jìn)行研究，為抗衰老的藥物研究提供可靠依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選用清潔級SD大鼠25只，周齡8～9周，體重160～180 g，由牡丹江醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號SCXK（黑）（2017-0001）金福菇多糖采用95%乙醇脫脂、水提取、濃縮、醇沉淀、經(jīng)除蛋白、透析以及真空干燥等程序提取分離純化，多糖含量大于95%，D-半乳糖為上海試劑二廠生產(chǎn)，RT-PCR引物為上海生工合成。

1.1.2 儀器 DK-S26型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；紫外-可見光光度計（上海光電研究所）；ELGA超純水機(jī)（Veolia Water System公司）；3K15高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma公司）；實(shí)時定量PCR儀（美國通用生物有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及分組 利用D-半乳糖破壞體內(nèi)氧化酶活性，形成更多氧化產(chǎn)物引起細(xì)胞損傷，導(dǎo)致機(jī)體功能衰退的原理[14-15]，進(jìn)行大鼠衰老模型的制備。在牡丹江醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心領(lǐng)取大鼠25只，首先將所有實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分成正常對照組、衰老模型組、大劑量治療組、中劑量治療組、小劑量治療組5組。正常對照組每天給予注射等量生理鹽水，1次/d，共42 d。給予其他組實(shí)驗(yàn)動物頸背部皮下注射D-半乳糖100 mg/kg，1次/d，連續(xù)給D-半乳糖42 d，建立亞急性衰老大鼠模型。同時每日以400、200、100 mg/kg金福菇多糖水溶液分別給予大、中、小劑量治療組進(jìn)行灌胃，正常對照組和衰老模型組給予等劑量的生理鹽水，治療周期為6周。

1.2.2 采集標(biāo)本及測定 5組大鼠于43 d后，最后一次給藥4 h后，采用頸椎脫臼法處死大鼠，取出大鼠的腦海馬區(qū)組織50～100 mg，采用液氮冷凍后放入研缽，加入1 mL RNA提取試劑（Trizol）進(jìn)行充分研磨，然后抽提勻漿移入1.5 mL的Ep管中，常溫放置5 min；每管加入0.2 mL氯仿，劇烈震蕩15 s，室溫放置2～3 min；4 ℃離心機(jī)12 000 r/min離心5 min；取水相后加入0.5 mL的異丙醇，混勻后室溫放置10 min。4 ℃離心機(jī)12 000 r/min離心5 min，去除上清液，加入1 mL 75%乙醇，搖勻后，4 ℃離心機(jī)7 500 r/min離心5 min，去除上清液，剩余部分倒置于超凈工作臺下干凈濾紙上，自然干燥10 min，加入20 μL DEpC水混勻，置于低溫冰箱保存。

1.2.3 檢測p16mRNA表達(dá) 根據(jù)Gen Bank提供的p16和內(nèi)參β-actin的 mRNA序列，應(yīng)用Primer 6.0軟件設(shè)計引物，其序列由Invitrogen公司合成。采用實(shí)時定量-逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行基因片段擴(kuò)增并定量，p16基因的上游引物為5-CTCCTTGGCTTCATTCTGG-3，下游引物為5-CTCCCTCCCTCTGCTAACCT-3，擴(kuò)增片段為342 bp；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為207 bp；RT-PCR反應(yīng)條件為：Trizol方法提取RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄CDNA第一鏈，反應(yīng)體積20 μL，37 ℃ 孵育15 min，85 ℃ 5 s終止反應(yīng)，滅活反轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物4 ℃保存。95 ℃，5 s，59 ℃，20 s，72 ℃，20 s，40循環(huán)。進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測及凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

將RNA提取，用A 260/A 280的比值均大于1.8的RNA樣品提取后，通過紫外線分光度計鑒別其濃度和純度，結(jié)果提取的總DNA質(zhì)量和純度都很好，可用于RT-PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin為參照，圖像分析結(jié)果顯示：衰老模型組小鼠p16基因表達(dá)明顯高于正常對照組，見圖1。金福菇多糖可有效降低大鼠海馬p16基因mRNA表達(dá)，給予金福菇多糖治療后p16基因相對表達(dá)明顯降低，衰老模型組p16基因[（0.205±0.018）μg/mL]表達(dá)明顯增加，與正常對照組[（0.167±0.013）μg/mL]相比，衰老模型組大鼠p16基因表達(dá)明顯增加（P<0.05）；與衰老模型組對比，小、中、大劑量治療組p16基因表達(dá)[（0.176±0.009）、（0.177±0.016）、（0.175±0.009）μg/mL]均明顯降低，其中中劑量組最低，但三組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)飛速發(fā)展，人們對衰老機(jī)制有了深層次的認(rèn)識，提出了許多學(xué)說，如：氧自由基占主導(dǎo)地位學(xué)說，其認(rèn)為造成機(jī)體衰老的原因是構(gòu)成生物的基本單位細(xì)胞衰老，隨著生物年齡的增長，平衡系統(tǒng)逐漸失衡，使得自由基過量而引起的生物衰老[16-17]。端粒假說，認(rèn)為染色體的端粒是維持染色體結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性的，隨著連續(xù)的細(xì)胞分裂，端粒逐步縮短，甚至完全丟失，細(xì)胞隨之發(fā)生老化并喪失分裂能力而死亡，這是老年人染色體端粒長度明顯低于年輕人的原因[18]?？傮w說來衰老是許多病理、生理和心理過程綜合作用的必然結(jié)果，是個體生長發(fā)育最后階段的生物學(xué)心理學(xué)過程，細(xì)胞衰老時，可有效抑制細(xì)胞的有絲分裂，刺激連鎖反應(yīng)產(chǎn)生RB蛋白的磷酸化，從而維持衰老細(xì)胞形成不可逆性的生長停滯狀態(tài)[19]。而衰老受某些基因的控制，其中p16基因是細(xì)胞衰老遺傳控制程序中的重要環(huán)節(jié)，當(dāng)細(xì)胞衰老時，p16基因的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平會明顯增高，目前認(rèn)為：其主要通過p16-cyclinD/CDK-RB途徑調(diào)控細(xì)胞周期，細(xì)胞增殖周期的調(diào)控與個體發(fā)育、分化、生長、衰老及癌變均有密切關(guān)系[20]。金福菇多糖對大鼠海馬p16基因mRNA表達(dá)對治療細(xì)胞衰老具有臨床意義，研究表明金福菇多糖可有效減少小鼠皮膚內(nèi)的羥脯氨酸含量，增加小鼠皮膚、血清、肝臟及心臟的SOD、CAT活性，并降低組織內(nèi)的MDA含量，由此可見在小鼠體內(nèi)金福菇多糖具有較好的抗氧化活性，可有效減緩糖代謝紊亂所產(chǎn)生的超氧陰離子的損害，從而在一定程度上延緩小鼠的衰老[21]，與本文研究成果一致。

本實(shí)驗(yàn)利用D-半乳糖破壞細(xì)胞功能，使機(jī)體的抗氧化防御系統(tǒng)衰退。持續(xù)給予動物體內(nèi)注射D-半乳糖，在醛糖還原酶催化下產(chǎn)生半乳糖醇，同時生成超氧陰離子，造成細(xì)胞膜脂質(zhì)受損，造成衰老；從而制備成大鼠衰老模型，通過觀察發(fā)現(xiàn)，金福菇多糖對D-半乳糖衰老大鼠p16基因mRNA的表達(dá)可有效降低p16基因表達(dá)，與正常對照組相比，衰老模型組小鼠p16基因表達(dá)明顯增加（P<0.05），給予金福菇多糖治療后，p16基因相對表達(dá)明顯降低，其中中劑量組最低，但是三組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。由此可見，金福菇多糖可降低p16 mRNA的表達(dá)，很可能是其改善衰老大鼠心臟的機(jī)制，利于從分子水平去探討金福菇多糖抗衰老的機(jī)制，為中藥防治衰老提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Costa Orsine J V，Novaes M C，Ramirez Asquieri E，et al.Determination of chemical antioxidants and phenolic compounds in the Brazi-lian Mushroom Agaricus sylvaticus[J].West Indian Med J，2014，63（2）：146-150.

[2] Schwartz B，Hadar Y.Possible mechanisms of action of mushroom-derived glucans on inflammatory bowel disease and associated cancer[J].Ann Transl Med，2014，2（2）：19.

[3] Ivanova T S，Krupodorova T A，Barshteyn V Y，et al.Anticancer substances of mushroom origin[J].Exp Oncol，2014，36（2）：58-66.

[4]謝春芹，凡軍民，謝正林，等.高職院校食用菌生產(chǎn)技術(shù)課程的教學(xué)改革與實(shí)踐[J].中國科技信息，2012，24（9）：208-209.

[5]杜云建，吳曉彤，蔡婕.酶解法提取雞腿菇多糖的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（16）：9818-9876.

[6]張衛(wèi)，吳煥淦，王米渠，等.中醫(yī)傳統(tǒng)衰老學(xué)說及其防治原則概述[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（2）：265-266.

[7]黃可，謝淑華，安寧，等.冬蟲夏草通過抗氧化及抗衰老減輕糖尿病腎病大鼠腎小管損傷的研究[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2014，11（22）：15-17.

[8]鄧優(yōu)錦，傅俊生，謝寶貴，等.野生金福菇的鑒定及其生物學(xué)特性研究[J].浙江食用菌，2008，16（6）：10-14.

[9] Leontieva O V，Blagosklonny M V.CDK4/6-inhibiting drugsubstitutes for p21 and p16 in senescence：duration of cellcycle arrest and MTOR activity determine geroconversion[J].Cell Cycle，2013，12（18）：3063

[10]余明蔚，王文恭.氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老過程中細(xì)胞生長相關(guān)基因的表達(dá)[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2012，28（2）：164.

[11] Wasiak T，MIonov K，Nieznanski H，et al.Phosphorus dendrimers affect Alzheimers （Aβ1-28） peptide and MAP-Tau protein aggregation[J].Molecular Pharmaceutics，2012，9（12）：458-469.

[12] Wang C，Chen Y，Hu M，et al.In vitro antioxidant activities of the polysaccharidesfrom Tricholoma lobayense[J].Intemational Journal of Biological Macromolecules，2012，50（3）：534-539.

[13]黃建忠，邵愛明.金福菇的生物學(xué)特征及其栽培技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009，14（4）：57-61.

[14]邱柏程，劉慶豐.D-半乳糖大鼠衰老模型的評價[J].廣西醫(yī)學(xué)，2009，31（7）：918-920.

[15]劉克明，王春花，李國星，等.D-半乳糖模型鼠與自然衰老鼠的比較研究[J].衛(wèi)生研究，2007，36（6）：685-688.

[16]胡作為，周燕萍，沈自尹，等.p16基因與細(xì)胞衰老關(guān)系的研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)·遺傳學(xué)分冊，2004，27（8）：200-202.

[17] Felippi C C，Oliveira D，Str?her A，et al.Safety and efficacy of an tioxidants-loaded nanoparticles for an anti-aging application[J].J Biomed Nanotechnol，2012，8（2）：316-321.

[18]任芳麗.端粒和端粒酶與衰老關(guān)系的研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2002，23（3）：19-20.

[19] Polj?ak B1，Dahmane R.Free radicals and extrinsic skin aging[J].Dermatol Res pract，2012，2012：135206.

[20]黃建忠，邵愛明.金福菇的生物學(xué)特征及其栽培技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009，4（11）：58-69.

[21] Dai D F，Rabinovitch P S，Ungvari Z.Mitochondria and cardiovas cular aging[J].Circ Res，2012，110（8）：1109-1124.