楊柳 滕李濛 黃內(nèi)力 景浩瑞 黃秋芳 鮑勇財(cái) 王美軒 余邦良 楊文

摘要 為探索海南石解（Dendrobium hainanense）和昌江石解（Dendrobium changjiangense）不同提取部位的體外抗菌效果，以金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌、白色念珠菌為受試菌株，采用倍比稀釋法、瓊脂平板法對(duì)海南石解和昌江石解不同部位進(jìn)行抗菌活性篩選，并考察對(duì)金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的生長(zhǎng)抑制曲線和電導(dǎo)率變化情況。結(jié)果表明，A、E能顯著抑制金黃色葡萄球菌的正常生長(zhǎng)，A對(duì)金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度（MIC）為2.5mg/mL，最低殺菌濃度（MBC）為5.0mg/mL;E對(duì)金黃色葡萄球菌MIC和MBC均為2.5mg/mL;且E極顯著增加金黃色葡萄球菌的滲透性。A、C、E顯著抑制白色念珠菌的正常生長(zhǎng)，F(xiàn)極顯著抑制白色念珠菌的正常生長(zhǎng)，增加白色念珠菌的滲透性，F(xiàn)對(duì)白色念珠菌的MIC和MBC均為1.25mg/mL。表明海南石解的乙酸乙酯部位對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)抗菌效果，昌江石解的乙酸乙酯部位對(duì)白色念珠菌具有較強(qiáng)抗菌效果，該結(jié)論為海南石解和昌江石解進(jìn)一步開發(fā)奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 海南石解;昌江石解;提取物;抗菌活性

中圖分類號(hào) S567.239 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

石解作為中國(guó)傳統(tǒng)藥材，具有滋陰清熱、生津益胃、潤(rùn)肺止咳等功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明：石斛化學(xué)成分較為復(fù)雜，主含有糖類、生物堿、菲類、香豆素、氨基酸等，具抗氧化、抗炎、降血糖、調(diào)血脂、抗菌等功效[1-4]，不同產(chǎn)地、品種、栽培時(shí)間的石解，其化學(xué)成分不同，藥效也不盡相同[5-6]。何勁等[7]從貴州產(chǎn)的金釵石解和流蘇石解中分離到4株具有強(qiáng)烈拮抗真菌的內(nèi)生細(xì)菌，結(jié)果表明，該菌對(duì)19株絲狀真菌有抑制作用。張周英等[8]從廣東產(chǎn)的鐵皮石解和金釵石解中提取多糖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從這兩種石解中提取的多糖對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎球菌均有明顯的抑菌作用。

海南石解（Dendrobium hainanense）和昌江石解（Dendrobium changjiangense）主要分布于海南三亞、陵水、瓊中、昌江、白沙、定安等地區(qū)[9]，為海南特有石解屬物種[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道，石解屬植物具有一定抗菌活性[1l-12]。目前，有關(guān)海南石解和昌江石解的研究報(bào)道較少。如張友源[13]等對(duì)海南石解化學(xué)成分進(jìn)行研究，尚未發(fā)現(xiàn)海南石解和昌江石解抗菌藥理活性報(bào)道。因此，為進(jìn)一步開發(fā)利用海南這2種天然石解資源，本文采用4種菌株，通過(guò)監(jiān)測(cè)抑制菌體生長(zhǎng)曲線，探究菌體電導(dǎo)率的變化和菌體細(xì)胞膜的滲透性影響，初步探討抗菌機(jī)制，以期為海南石解和昌江石解作為天然植物類抗菌藥物開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2016年9月采自海南省昌江縣霸王嶺，經(jīng)鑒定，為蘭科石解屬海南石解（D.hainanense）和昌江石解（D.changjiangense），現(xiàn)存放于海南醫(yī)學(xué)院化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，編號(hào)分別為HNSH-201609、CJSH-201609。

1.1.2 菌株

金黃色葡萄球菌（S.aureas ATCC 25923）、白色念珠菌（C.albicans ATCC 10231）、大腸桿菌（E.coliATCC 25922）、肺炎克雷伯菌（K pneumoniae ATCC13883）均購(gòu)自廣東省菌種保藏中心。

1.1.3 試劑

沙保羅氏瓊脂、沙保羅液體增菌培養(yǎng)基（杭州濱和微生物試劑有限公司）; MH肉湯培養(yǎng)基（青島高科園海博生物技術(shù)有限公司）;MH瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱生物科技有限公司）;DMSO（阿拉丁試劑有限公司）;酯酸氯己定（成都第一制藥原料藥有限公司）;萬(wàn)古霉素（浙江海正藥業(yè)股份有限公司）;吐溫80、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇（均為分析純，購(gòu)于西隴化工股份有限公司）。

1.1.4 儀器

RE-52CS-2型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;DZF-6050型真空減壓干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;SPX-150B-2Z型生化培養(yǎng)箱（上海博遠(yuǎn)實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;LDZX-40BI型高壓消毒鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）;THZ-1038型恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;UV1800PC型紫外可見(jiàn)分光（海鳳凰光學(xué)科儀有限公司）;SP-DJ系列凈化工作臺(tái)（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）;DDS-12A型電導(dǎo)率儀（上海虹益儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 不同提取物的制備

參照張友源等[13]方法，制得海南石斛乙醇部位（A） 163.5g、昌江石解乙醇部位（B）147.8g、海南石解石油醚部位（C）24.4g、昌江石解石油醚部位（D）20.8g、海南石斛乙酸乙酯部位（E）22.6g、昌江石解乙酸乙酯部位（F）12.4g、海南石斛正丁醇部位（G）17.3g、昌江石斛正丁醇部位（H）16.9g。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及樣品溶液的制備

稱取A、B、C、D、E、F、G、H各400mg、分別加入10mL、10%DMSO水溶液，滴入10滴吐溫80，超聲溶解至溶液澄清，配制成待測(cè)樣品溶液，以不加樣品作為對(duì)照。稱取400mg的萬(wàn)古霉素（酯酸氯己定），用相同溶劑溶解，作為檢測(cè)細(xì)菌（真菌）的陽(yáng)性藥物。其他分組如表1、表2所示。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)菌液的配制

參照中國(guó)藥典方法[14]，分別配制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、白色念珠菌菌液，稀釋至濃度均為1×10⁶CFU/mL。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

采用倍比稀釋法[15]，取1～7號(hào)試管，分別加入體積相同已配好的MH肉湯液體培養(yǎng)基（細(xì)菌培養(yǎng)）或沙氏液體培養(yǎng)基（真菌培養(yǎng)），將待測(cè)樣品溶液或陽(yáng)性藥物從1號(hào)管依次倍比稀釋至7號(hào)管，使待測(cè)樣品濃度分別為20.000、10.000、5.000、2.500、1.250、0.625、0.312mg/mL。8號(hào)試管加入3mL 10%DMSO水溶液（3滴吐溫80）;9號(hào)試管加入3mL培養(yǎng)基溶液;用移液器吸取100μL細(xì)菌（1×10⁶CFU/mL）依次加入1～9號(hào)試管內(nèi)，10號(hào)試管不加受試菌，加入3mL不同部位提取物和3mL培養(yǎng)基溶液;11號(hào)試管不加受試菌，加入3mL不同部位提取物溶液。搖勻，置于37℃恒溫箱內(nèi)，細(xì)菌考察培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，真菌考察培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果。在對(duì)照管符合要求的情況下[15]，凡無(wú)肉眼可見(jiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的不同部位提取物最低濃度即為待測(cè)藥物對(duì)該測(cè)試菌的MIC。

1.2.5 最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定

分別從觀察MIC試管中移取O.1mL溶液于相應(yīng)培養(yǎng)基瓊脂平板上作次代培養(yǎng)，置于37℃恒溫箱內(nèi)，細(xì)菌考察培養(yǎng)24h后觀察結(jié)果，真菌考察培養(yǎng)48h后觀察結(jié)果，觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)。以無(wú)菌落生長(zhǎng)的藥物濃度作為該受試菌的MBC[15]。

1.2.6 細(xì)菌生長(zhǎng)抑制曲線的影響

取有抑菌、殺菌效果的不同部位與相應(yīng)作用的菌株，考察該菌在藥物作用下對(duì)菌體生長(zhǎng)抑制情況。根據(jù)1.2.5結(jié)果進(jìn)行分組：待測(cè)藥物組、不加菌的培養(yǎng)基為參比組，不加藥物只加菌和培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照組（菌液濃度為1×10⁶CFU·mL^-1）。以1倍MIC和2倍MIC藥物濃度值為考察點(diǎn)，以上各實(shí)驗(yàn)組均加入相應(yīng)的培養(yǎng)基（肉湯培養(yǎng)基或沙氏培養(yǎng)基），置于37℃、120r/min培養(yǎng)，每隔2h取樣，細(xì)菌培養(yǎng)24h，真菌培養(yǎng)48h于波長(zhǎng)600nm處測(cè)定吸光度。以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制曲線[16-17]。

1.2.7 對(duì)金黃色葡萄球菌和白色念珠菌細(xì)胞膜滲透性的影響

根據(jù)1.2.5、1.2.6實(shí)驗(yàn)結(jié)果，參照前人方法[18]，分別將濃度為1MIC、2MIC的藥物、40mg/mL萬(wàn)古霉素（酯酸氯已定）加入帶菌懸液的培養(yǎng)基中，陽(yáng)性對(duì)照組為菌體培養(yǎng)基，置于37℃恒溫培養(yǎng)，分別于0、2、4、6、8、10、12h取樣，測(cè)量電導(dǎo)率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，電導(dǎo)率為縱坐標(biāo)繪制曲線，觀察各個(gè)部位對(duì)菌體細(xì)胞膜滲透的影響。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用單因素t檢驗(yàn)方法，SPSS19.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定

由于受試藥物為有色非透明物質(zhì)，需要平板劃線觀察MIC。以小于5個(gè)菌落，且菌落數(shù)明顯少于陽(yáng)性對(duì)照組所對(duì)應(yīng)試管最大稀釋度的藥物濃度為MIC[19-20]。由表1～3可知，對(duì)于金黃色葡萄球菌：A，E抑菌和殺菌效果比較好，A的MIQV2.5mg/mL、MBC為5mg/mL，E的MIC和MBC均為2.5mg/mL;F、G的抑菌和殺菌效果較差，F(xiàn)的MIC為10mg/mL、MBC為20mg/mL，G的MIC、MBC均為20mg/mL;A、E、F、G的抑菌、殺菌效果呈現(xiàn)量效關(guān)系，其他部位對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有明顯的抑菌、殺菌效果。對(duì)于白色念珠菌：C、E、F均有較強(qiáng)的抑菌、殺菌效果，其MIC分別為2.5、5、1.25mg/mL，MBC分別為2.5、5、1.25mg/mL;其中F在1.25～5mg/mL具有較強(qiáng)的的抑菌、殺菌效果，但濃度達(dá)10、20mg/mL后抑菌、殺菌效果較差，這種在一定濃度范圍具有殺菌的作用與75%乙醇性質(zhì)相似，并沒(méi)有明顯呈現(xiàn)藥物作用的量效關(guān)系;A、C、E與陽(yáng)性對(duì)照相比，差異顯著;F與陽(yáng)性對(duì)照相比，差異極顯著。2種石解的8個(gè)不同部位對(duì)大腸桿菌和肺炎克雷伯菌均沒(méi)有任何抗菌的效果。

2.2 細(xì)菌生長(zhǎng)抑制曲線的影響

選擇A、E、F、G考察對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)抑制情況，選擇A、B、C、E、F考察對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)抑制情況。由圖1可知，金黃色葡萄球菌的陽(yáng)性對(duì)照組在8h之前細(xì)菌繁殖較慢，為細(xì)菌生長(zhǎng)的遲緩期，隨后生長(zhǎng)繁殖速度加快，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;A、E、F、G高濃度和低濃度溶液處理后的金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)均受到一定的抑制，且隨著藥物濃度的增加，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用增強(qiáng)，說(shuō)明具有一定量效關(guān)系。其中A、E與陽(yáng)性對(duì)照間差異顯著，能有效抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)。

由圖2、3可知，白色念珠菌陽(yáng)性對(duì)照組16h之前生長(zhǎng)繁殖較慢，隨后速度增加，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，30 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，其吸光值為1.998。A、B、C、E、F高濃度和低濃度處理后的白色念珠菌生長(zhǎng)均受到一定的抑制，吸光值增長(zhǎng)速度較慢，在菌體對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期吸光值增長(zhǎng)速度顯著小于陽(yáng)性對(duì)照，說(shuō)明菌體繁殖速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陽(yáng)性對(duì)照組。A、C、E與陽(yáng)性對(duì)照間差異顯著;F與陽(yáng)性對(duì)照間差異極顯著。藥物濃度越高，抑制菌體生長(zhǎng)越明顯。藥物作用后的菌體在整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)，吸光度先上升后下降，這也許是由于藥物使細(xì)菌自身發(fā)生了應(yīng)激反應(yīng)，使菌體在一定時(shí)間內(nèi)決速生長(zhǎng)，隨后菌體生長(zhǎng)被抑制，出現(xiàn)曲線下降趨勢(shì)，說(shuō)明A、C、E、F對(duì)菌體生長(zhǎng)具有較好的抑制作用，這與周本宏[21]結(jié)論相似。

由此可見(jiàn)，A、E對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好抑菌效果，F(xiàn)對(duì)金黃色葡萄球菌具有一定抑菌效果，C、E、F對(duì)白色念珠菌具有較好抑菌效果。

2.3 對(duì)菌體細(xì)胞膜滲透性的影響

選擇A、E、F考察金黃色葡萄球菌對(duì)電導(dǎo)率的影響，選擇C、E、F考察白色念珠菌對(duì)電導(dǎo)率的影響。由圖4可知，對(duì)于金黃色葡萄球菌：與陽(yáng)性對(duì)照相比，E的兩個(gè)濃度電導(dǎo)率增加較快，差異極顯著;與萬(wàn)古霉素比較，E的兩個(gè)濃度電導(dǎo)率差異不顯著，說(shuō)明其對(duì)菌體細(xì)胞膜的滲透性相似（P>0.05）。對(duì)于白色念珠菌：與陽(yáng)性對(duì)照相比，F(xiàn)和高濃度E電導(dǎo)率增加較快，差異不顯著;與酯酸氯己定比較，F(xiàn)的低濃度電導(dǎo)率差異不顯著，說(shuō)明其對(duì)菌體細(xì)胞膜的滲透性相似（P>0.05）。

3 討論與結(jié)論

張?jiān)趶?qiáng)等[2]發(fā)現(xiàn)，迭鞘石解醇提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌和殺菌作用較好;王琳等[11]發(fā)現(xiàn)，齒瓣石解提取物對(duì)金黃色葡萄球菌抗菌效果較好。本研究通過(guò)4種菌株對(duì)海南石解和昌江石解不同提取部位抗菌活性進(jìn)行篩選，采用倍比稀釋法和瓊脂平板法對(duì)8個(gè)不同部位進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn)，測(cè)定各個(gè)部位的MIC和MBC值。結(jié)果表明，對(duì)金黃色葡萄球菌：A、E抑菌、殺菌效果比較好，F(xiàn)、G抑菌作用較弱，B、C、D沒(méi)有抑菌、殺菌作用;對(duì)白色念珠菌：A、C、E、F均有較強(qiáng)的抑菌、殺菌效果，B有一定抑菌、殺菌效果，D、G、H沒(méi)有抑菌、殺菌效果。該方法是目前體外抗菌活性篩選的常用方法，可行性較高。其研究結(jié)果與前人結(jié)論相似，海南石解和昌江石解對(duì)金黃色葡萄球菌抗菌的MIC值均比前人報(bào)道的石解屬其他石解的MIC值低[2，11-12]，但這2種石解的不同提取部位對(duì)白色念珠菌的抗菌效果較好，這值得進(jìn)一步研究。

采用具有抗菌活性部位的MIC、2MIC兩個(gè)不同濃度，考察對(duì)金黃色葡萄球菌和白色念珠菌菌體正常生長(zhǎng)抑制性及對(duì)菌體細(xì)胞膜滲透性。結(jié)果表明，E能有效抑制金黃色葡萄球菌正常生長(zhǎng)，提高菌體細(xì)胞膜的滲透性，與萬(wàn)古霉素抗細(xì)菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，具有很好抗菌效果，該結(jié)論與尹永潔[22]研究結(jié)果相似;E對(duì)金黃色葡萄球菌抗菌效果較好，這與張薇薇等[12]疊鞘石解水提取部位對(duì)金黃色葡萄球菌具有較好的抗菌活性的研究結(jié)果不同。F能有效抑制白色念珠菌正常生長(zhǎng)，且能夠提高菌體細(xì)胞膜的滲透性，與酯酸氯已定抗細(xì)菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似（P>0.05），具有較好抗真菌效果，這與吳晶[23]結(jié)論相似。

綜上所述，海南石解的乙酸乙酯部位對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)抗菌效果，昌江石解的乙酸乙酯部位對(duì)白色念珠菌具有較強(qiáng)抗菌效果。本研究初步探究了石解體外抗菌的機(jī)制，為以后開發(fā)抗菌藥物奠定前期基礎(chǔ)。

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