李萍萍 張月 吳小芳 黎舒懷 陽辛鳳

摘要 樣品采用乙酸乙酯提取，GC-FPD快速篩查目標農(nóng)藥?？梢申栃詷悠诽崛∫航?jīng)400mgPSA、400mgGCB凈化后，GC-MS確證，溶劑外標法定量。結果表明：GC-FPD和GC-MS中15種有機磷農(nóng)藥在0.01～0.50μg/mL范圍內線性關系良好，決定系數(shù)（r²）均大于0.99，檢出限（LOD）均低于為0.003mg/kg。GC-FPD平均回收率在72%～116%，相對標準偏差（RSD）（n=5）在5.2%～16%。GC-MS平均回收率在71%～108%，相對標準偏差（RSD）（n=5）在3.1%～17%。說明試驗建立的氣相色譜法在實際應用中可行，該方法簡便、快速、成本低廉、適用于5種海南冬季瓜菜中快速篩查和確證15種有機麟農(nóng)藥殘留。

關鍵詞 QuEChERS;GC-FPD;GC-MS;海南冬季瓜菜;有機磷農(nóng)藥殘留

中圖分類號 S412 文獻標識碼 A

海南是我國冬春瓜菜生產(chǎn)的3大優(yōu)勢區(qū)域之一，是全國“菜籃子工程”建設的重要組成部分[1-2]。然而海南島高溫高濕的氣候條件在適合瓜菜生長的同時，也有利于病蟲害的發(fā)生。海南冬季瓜菜主要有豇豆、辣椒、西瓜、苦瓜、五指山野菜等，其危害最為嚴重的蟲害為蚜蟲、薊馬、螨蟲等。有機磷類農(nóng)藥是廣譜殺蟲劑和殺螨劑，廣泛應用于瓜菜生產(chǎn)的蟲害防治[3]。然而豇豆、辣椒、西瓜、苦瓜、五指山野菜等瓜菜中均未登記有機磷農(nóng)藥。為防治病蟲害，菜農(nóng)存在不合理使用農(nóng)藥的現(xiàn)象，尤其病蟲害發(fā)生嚴重的冬季呈現(xiàn)“用藥頻率高、混合種類多”的特點。農(nóng)藥殘留問題已成為制約“冬種北運”蔬菜發(fā)展的主要障礙。如連續(xù)幾年海南豇豆農(nóng)殘超標事件[1]，2015年“海南毒西瓜”事件等給當?shù)剞r(nóng)業(yè)造成重大損失[4]。因此，加強對海南冬季瓜菜中農(nóng)藥殘留的監(jiān)測對于我國瓜菜產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展及保障市民‘餐桌安全”具有十分重要的意義。

關于果蔬中有機磷類農(nóng)藥殘留的檢測方法較多，NY/T761-2008和王海鳳等[5]采用乙腈提取，提取液經(jīng)過濾濃縮后，再用氣相色譜測定;李曉穎等[6]采用乙腈提取，固相萃取柱凈化后，供氣相色譜-四極桿飛行時間質譜鑒定。葉瑞洪等尸]采用乙腈提取，QuEChERS凈化后直接用超高效液相色譜一串聯(lián)質譜分析。沈偉健等[10-12]采用QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質譜法測定果蔬中幾十種農(nóng)藥殘留量。采用NY/T761-2008前處理時有機溶劑用量大，濃縮時的提取溶液揮發(fā)對檢測人員的健康造成傷害，且該方法耗時、費力，不適于檢測人員較少，而檢測樣品量較大的實驗室的日常分析。氣相色譜/液相色譜一串聯(lián)質譜儀、氣相色譜/液相色譜-飛行時間質譜儀定性準確度高，克服樣品的假陽性問題，且可同時測定多種農(nóng)藥殘留，但儀器成本昂貴，不適于普通實驗室的常規(guī)配置[13]。QuEChERS方法[14]作為最新的前處理方法具有快速、簡單、成本便宜等優(yōu)勢，已廣泛應用于各類基質中的農(nóng)藥殘留測定。GC-FPD具有靈敏度高、儀器價格低、對樣品凈化程度要求低、維護簡單等特點。本研究選擇5種主要海南冬季瓜菜中常用的15種有機磷類農(nóng)藥，采用乙酸乙酯提取后，提取液直接用GC-FPD檢測。發(fā)現(xiàn)可疑陽性樣品后，采用QuEChERS方法結合GC-MS法測定。本方法簡便、快速、成本低，適用于海南冬季批量出島瓜菜中有機磷類農(nóng)藥殘留的快速篩查和檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

Trace GC氣相色譜儀，配有火焰光度檢測器（FPD）（USA，Therma公司）;Anke TDL-40B離心機（上海安亭科學儀器廠）;多管渦旋混合器UMV-2（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司）。Agilent7890A+5975C氣質聯(lián)用儀（單四級桿，美國安捷倫公司）。

1.1.2 試劑

巧種農(nóng)藥標準品：毒死蜱、氧樂果、倍硫磷、馬拉硫磷、丙溴磷、水胺硫磷、樂果、三唑磷、甲拌磷、甲基異柳磷、殺螟硫磷、敵敵畏、甲基對硫磷、對硫磷、特丁硫磷，濃度均為1000.0μg/mL，均購自中國標準開發(fā)公司標樣開發(fā)部。

乙腈、丙酮、甲醇、乙酸乙酯（色譜純，F(xiàn)isher公司）;氯化鈉、無水硫酸鎂為分析純（廣州化學試劑廠）;多壁碳納米管（MWCNT，直徑10～20nm，長度10～30μm，純度95%，中國科學院成都有機化學有限公司）;C18吸附劑、GCB粉末、PSA吸附劑（美國安捷倫公司）。

1.1.3 試材

供試豇豆、辣椒、西瓜、苦瓜、五指山野菜均購自海口農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理（篩查）

準確稱取10.00g樣品于50mL離心管中，加入10mL乙酸乙酯溶液，劇烈震蕩1min，再加入5gNaCl，渦旋1min，以4500r/min高速離心5min后，吸取上清液，供GC-FPD檢測。

1.2.2 GC-FPD條件

DM-17（30m×0.53mm，1.0μm）毛細管氣相色譜柱;載氣：氮氣（99.999%），恒流模式：流速為7.0mL/min;氫氣流速為85mL/min，空氣流速為110mL/min，不分流進樣;進樣口溫度：240℃;檢測器基座溫度300℃，檢測器（FPD）溫度150℃;程序升溫條件：初始溫度110℃，保持1.0min，以25℃/min升至250℃，保持6.0min，再以40℃/min升至260℃，保持4.0min。

1.2.3 樣品前處理（陽性樣品確證）

若GC-FPD檢出陽性樣品，需對其進行確證。按照1.2.1步驟離心后，準確移取5.0mL上清液加入15mL含有400mg PSA、400mg GCB、1200mgMgSO₄的離心管中，劇烈震蕩1.0min，以4500r/min高速離心1.0min后，吸取上清液，供GC-MS。

1.2.4 GC-MS條件

HP-5（30m×0.25mm，0.25μm）毛細管氣相色譜柱。載氣：氦氣（99.999%），恒流模式：流速為1.0mL/min，不分流進樣;進樣口溫度：250℃;程序升溫條件：初始溫度80℃，保持1.0min，以20℃/min升至200℃，保持3.0min;再以10℃/min升至250℃，保持4.0min。GC-MS接口溫度280℃;電子轟擊源70eV;離子源溫度230℃;掃描方式：選擇離子掃描。

1.2.5 標準溶液的配制及標準曲線繪制

單標儲備液：準確移取1.0mL各標準品，用丙酮配成100μg/mL的單標準儲備液，于-20℃保存?；旌蠘藴手虚g液（2組）：將巧種農(nóng)藥分2組，按照表1中組別，分別移取1.0mL，單標儲備液，用丙酮稀釋配制成2組4μg/mL混合標準中間液，于-20℃保存。溶劑標準工作溶液：準確移取一定量的混合標準中間液，再用乙酸乙酯稀釋成質量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.20和0.50μg/mL的2組溶劑標準工作溶液?；|標準工作溶液：準確移取一定量的混合標準中間液，用1.2.1步驟的空白樣品提取液配制成0.01、0.05、0.10、0.20和0.50μg/mL的2組基質標準工作溶液。溶劑標準工作溶液和基質標準工作溶液現(xiàn)配現(xiàn)用，外標法定量。將工作溶液按1.2.2 條件測定，以標準品的質量濃度為橫坐標，相應峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.6 添加回收試驗

選擇豇豆、五指山野菜、苦瓜、西瓜和辣椒5種供試陰性蔬菜樣品，分別添加0.01、0.05、0.1mg/kg 3個水平的標準品溶液，按本文所建方法測定，每個水平重復5次，計算平均回收率和相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 料液比的優(yōu)化

以豇豆為例，本實驗考察了3種料液比對農(nóng)藥提取效果的影響：①料液比為1：1，即10g樣品中加入10mL，乙酸乙酯。②料液比為2：1，即10g樣品中加入5mL，乙酸乙酯。③料液比為1：2，即109樣品中加入20mL，乙酸乙酯。在空白樣品基質中添加0.1mg/kg的15種農(nóng)藥，對比回收率達到70%～120%的化合物個數(shù)百分比。結果（圖1）顯示，料液比為2：1時，15種有機磷農(nóng)藥中只有63%的化合物回收率達到70%～120%，表明提取液不能完全浸沒樣品，提取效率低。料液比為1：1和1：2時15種有機磷化合物回收率均在80%以上，表明巧種農(nóng)藥提取完全。因此，為提高提取效果及節(jié)約提取溶液，減少污染及降低成本，本實驗選擇料液比為1：1。

2.2 緩沖體系的選擇

以豇豆為例，本實驗考察了3種緩沖體系的效果，①未加緩沖鹽：10mL乙酸乙酯，5g氯化鈉;②檸檬酸鹽緩沖體系：10mL，乙酸乙酯，1.0g檸檬酸鈉，0.5g檸檬酸氫二鈉、1.0g氯化鈉、4.0g無水硫酸鎂。③乙酸鹽緩沖體系：10mL，1%乙酸-乙酸乙酯，1.0g乙酸鈉、4g無水硫酸鎂。在空白樣品基質中添加0.1mg/kg的巧種農(nóng)藥，對比3種緩沖體系提取下15種目標農(nóng)藥化合物的回收率。結果（圖2）表明：采用3種不同的緩沖體系，所有供試農(nóng)藥的回收率均在70%～120%之間，提取效果相差不大，因此為簡化操作步驟，本實驗選擇①10mL乙酸乙酯，5g氯化鈉提取目標農(nóng)藥。

2.3 分散固相萃取吸附劑的優(yōu)化

GC-FPD無法對陽性樣品進行準確定性，GC-MS對目標物的定性能力強，但GC-MS對上機液凈化要求比較高，因此本研究比較了在5種蔬菜基質中分別采用4種凈化吸附劑：①150mg PSA+45mgGCB+1200mgmgSO₄;（2）400mgPSA+400mgGCB+400mgC18+1200mgmgSO₄;③400mgPSA+400mgGCB+1200mgMgSO₄;④60mgMWCNT+1200mgmgSO₄對15種農(nóng)藥在GC-MS的凈化效果影響。結果表明：瓜菜提取液經(jīng)②、③凈化后溶液透明、無顏色且回收率在70%～120%（圖3），為避免材料浪費，綜合考慮，最終選擇組合③400mg PSA+400mg GCB）作為陽性樣品確證實驗的吸附劑。

2.4 基質效應評價

在質量濃度范圍內，以溶劑標準工作溶液和基質匹配標準工作溶液，繪制15種目標農(nóng)藥的標準曲線，計算目標農(nóng)藥的基質效應?；|效應（ME）通過下式計算：基質效應（ME）=（B-A）/A×100%，式中，A為純溶劑中標準曲線的斜率;B為基質匹配標準曲線的斜率[15]。根據(jù)HE等[16]關于基質效應的劃分，弱基質效應（|ME|<20%）可以忽略不計，中等基質效應（20%≤|ME|≤50%）或者強基質效應（|ME|>50%）必須用特定的方法克服基質效應[17-18]，通常采用基質匹配標準來避免基質效應。本研究結果（表1）表明：在豇豆等5種果蔬基質中，15種有機磷農(nóng)藥在氣相色譜（GC-FPD）中均表現(xiàn)為弱基質效應，因此本研究中可采用溶劑標準對目標農(nóng)藥進行定量和定性分析。

2.5 分析方法的準確度、靈敏度和精密度

將1.2.5節(jié)中配制好的10～500μg/L系列濃度混合標準工作溶液按1.2.2 所述GC-FPD條件進樣，以各個農(nóng)藥的峰面積y對質量濃度×（μg/L）做標準曲線，得到各個農(nóng)藥的線性方程及相關系數(shù)。結果表明（表1～2），巧種有機磷農(nóng)藥在10～500μg/L范圍內線性關系良好，決定系數(shù)（R²）均大于0.99，按信噪比（S/N）等于3計算，15種有機磷農(nóng)藥在GC-FPD中的檢出限（LOD）均低于0.003mg/kg。在0.01、0.05和0.10mg/kg3個添加水平下，GC-FPD平均回收率在72%～116%，相對標準偏差（RSD）（n=5）在5.2%～16%。在豇豆空白樣品中添加0.10mg/kg標準溶液的GC-FPD譜圖見圖3～4。

為驗證本文所建立的QuEChERS-GC/MS的靈敏度和回收率，在0.01mg/kg水平下做添加回收試驗，結果顯示：海南冬季豇豆、辣椒等5種瓜菜的平均回收率在71%～108%，相對標準偏差（RSD）（n=5）在3.1%～17%。表明該方法的準確度與精密度均能滿足于海南冬季瓜菜15種農(nóng)藥殘留量的日常確證工作。

3 討論

本研究中采用乙酸乙酯提取后直接供GC-FPD快速篩查海南冬季瓜菜中巧種有機磷農(nóng)藥殘留，可疑陽性樣品提取液經(jīng)QuEChERS凈化、GC-MS確證的農(nóng)藥殘留方法。本研究與文獻報道的相關研究有部分差異，Anastassiades等[14]首次將QuECHRS方法用于測定蔬菜和水果中的農(nóng)藥殘留，其測定過程中使用乙腈作為提取劑，PSA作為凈化劑，提取、凈化后的乙腈上清液直接用于GC-MS檢測目標農(nóng)藥。潘守奇等[19]將QuEChERS/GC方法用于測定蔬菜中農(nóng)藥殘留，其測定過程中使用0.1%乙酸-乙腈提取，C18、石墨碳黑、PSA等吸附劑凈化，GC-FPD檢測目標農(nóng)藥。徐國鋒等[20]建立了QuEChERS/氣相色譜法測定水果中農(nóng)藥殘留，其樣品采用乙睛提取，C18凈化，GC-FPD檢測。甘靜妮等[11]建立了QuEChERS/氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜測定蔬菜和水果中農(nóng)藥殘留。其方法采用1%乙酸乙腈提取后，經(jīng)PSA和GCB吸附劑凈化后，取部分上清液蒸干后丙酮復溶GC-MS/MS檢測。以上幾種QuEChERS前處理方法均采用乙腈作為提取溶劑且都需要凈化劑凈化。乙腈膨脹系數(shù)大、極性強、毒性大，極易引起襯管過載現(xiàn)象且損傷色譜柱，因此乙腈提取液不宜直接進入氣相色譜分析。本研究采用乙酸乙酯提取后上清液直接用于GC-FPD篩查目標農(nóng)藥，克服了乙腈極易損傷氣相色譜系統(tǒng)的缺點，充分利用GC-FPD抗污染能力強、設備維護簡單、儀器價格低以及普及率高的優(yōu)點，篩查樣品無需凈化劑凈化也節(jié)約了檢測成本和檢測時間。

自然界中常見的蔬菜水果種類有幾百種，一種QuEChERS凈化包并不能適合所有的蔬菜水果樣品。目前相關文獻報道中尚未見針對海南主要的冬季瓜菜：豇豆、辣椒、西瓜、苦瓜、五指山野菜等基質的QuEChERS凈化材料。由于海南主要冬季瓜菜種類較多、色素、糖分等成分含量不同，因此要篩選出一種合適的凈化劑，既要符合海南冬季瓜菜基質特點，達到基質凈化效果又能保證巧種農(nóng)藥的回收率，以及避免填料過多等造成的浪費。目前常用的吸附材料有PSA、C18、GCB.MWCNT（多壁碳納米管）作為一種新興的基質凈化材料已在很多基質中得到應用，PSA填料主要用于去除基質中的糖類和脂肪酸，C18主要用于去除油脂和其他非極性干擾物，GCB主要用于去除基質中的色素、甾醇類等雜質[10]。MWCNT是一種多孔的材料，比表面積較大，可以吸附基質中的雜質達到凈化的目的[21]。

本研究比較了新興的MWCNT（多壁碳納米管）凈化材料與常用的PSA、C18、GCB的凈化材料，發(fā)現(xiàn)400mg PSA+400mg GCB可以達到以上5種海南主要冬季瓜菜基質凈化目的。本方法采用將疑似陽性樣品提取液經(jīng)PSA和GCB凈化后GC-MS檢測確證。一方面，避免了所有樣品進入GC-MS檢測增加儀器污染頻率。另一方面，凈化劑凈化后上機檢測克服GC-MS易受樣品污染影響檢測結果的缺點。發(fā)揮GC-MS定性能力強、定性準確率高的優(yōu)點。該方法前處理簡單、快速、工作強度小，能大大提高基層檢測機構的檢測質量和檢測通量，適用于海南冬季批量出島瓜菜的農(nóng)殘快速篩查與確證，具有實際應用價值。

參考文獻

[1]梁偉紅，羅微，劉燕群，等.海南冬季瓜菜產(chǎn)業(yè)風險及可持續(xù)發(fā)展對策研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2013，41（10）：431-433.

[2]羅紅霞，王玲玲，李玉萍，等.海南冬季瓜菜種植區(qū)劃系統(tǒng)構建探討[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學，2014，34（8）：26-29.

[3]高堯華，滕爽，周婷婷，等.氣相色譜/串聯(lián)三重四級桿質譜法測定辛辣食品中25種有機磷農(nóng)藥殘留[J]化學試劑，2017，39（10），1083-1087.

[4]侯媛媛，賀滉.SWOT框架下海南冬季瓜菜供應機制研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學，2015，43（11）：618-621.

[5]王海鳳，王俊斌，劉海學，等.氣質聯(lián)用法同時測定果蔬中多種有機磷農(nóng)藥殘留[J].食品與機械，2013，29（1）：92-94.

[6]李曉穎，張紅醫(yī)，常巧英，等.氣相色譜-四級桿飛行時間質譜準確鑒定常見水果蔬菜中的農(nóng)藥殘留[J].色譜，2014，32（3）：268-277.

[7]葉瑞洪，蘇建峰.分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定果蔬、牛奶、植物油和動物肌肉中殘留的61種有機磷農(nóng)藥[J].色譜，2011，7，618-623.

[8]林濤，邵金良，劉興勇，等QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定蔬菜中41種農(nóng)藥殘留[J].色譜，2015，33（3）：235-241.

[9]李曼，張嘉楠，孟憲杰.基質分散固相萃取結合UPLC-MSIMS測定蔬菜及水果中50種農(nóng)藥殘留[J].生物技術世界，2016（5）：62-63.

[10]沈偉健，余可壵，桂茜雯，等.分散固相萃取-氣相色譜一串聯(lián)質譜法測定蔬菜中107種農(nóng)藥的殘留量[J].色譜，2009，27（4）：391-400.

[11]甘靜妮，程雪梅，莫曉君，等.分散固相萃取/氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜測定蔬菜和水果中67種農(nóng)藥殘留[J].分析測試學報，2016，35（12）：528-1534.

[12]周蓉，曹趙云，趙肖華，等.分散固相萃取一分散液液微萃取/氣相色譜-串聯(lián)質譜法測定蔬菜中19種有機磷農(nóng)藥殘留[J].分析測試學報，2017，36（1）：67-72.

[13]田宏哲，白雪松，苑馨方，等.氣相色譜-電子捕獲檢測器同時測定瓜果類蔬菜中15種除草劑殘留[J].農(nóng)藥學學報，2016，18（5）：625-632.

[14]Anastassiades M，Lehotay S J，Stajnbaber D，et al.Fast andeasy multiresidue methodcmploying acetonitrile extraction/partitioning and“dispersive solid-phase extraction”forthe determination of pesticide residues in produce[J].Journalof Aoac Internationa，2003，86（2）：412-431.

[15]王峰恩，鄧立剛，李霞，等.QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定飼草中10種農(nóng)藥殘留[J].農(nóng)藥學學報，2017，19（1）：68-75.

[16]He Z，Wang L，Peng Y，et al.Multiresidue analysis ofover 200 pesticides in cereals using a QuEChERS and gaschromatography-tandem mass spectrometry-based method[J].Food Chemistry，2015，169，372-380.

[17]王聽璐，賈琪，許彥陽，等.QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定草莓中甲基硫菌靈、多菌靈和乙嘧酚殘留[J].農(nóng)藥學學報，2017，19（5）：603-608.

[18]汪傳炳，黃秀根，樊曉青，等.微量疊加定量法校準蔬菜農(nóng)藥殘留色譜分析中的基質效應[J].上海農(nóng)業(yè)學報，2013，29（4）：36-41.

[19]潘守奇，孫軍，董靜，等.氣相色譜法同時測定蔬菜中24種有機磷農(nóng)藥殘留[J].分析試驗室，2010，29（1）：115-118.

[20]徐國鋒，聶繼云，李海飛，等.QuEChERS/氣相色譜法測定水果中31種有機磷農(nóng)藥殘留[J].分析測試學報，2016，35（8）：1021-1025.

[21]Deme P，Upadhyayula V V R.Ultra performance liquidchromatography atmospheric pressure photoionization highresolution mass spectrometric method for determination ofmulticlass pesticide residues in grape and mango juices[J].Food Chemistry，2015，173，1142-1149.