李嘉 邰思超 王瑤堯 金戈 馬駿 李岳春 余艷 廖偉芳 林加鋒 戴克智

病毒性心肌炎多由柯薩奇B3病毒（coxsackievirus B3，CVB3）感染引起，病毒在心肌細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制不但引起直接損傷，還刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子介導(dǎo)免疫損傷[1-2]。傳統(tǒng)認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞比例失衡可能是影響病毒性心肌炎疾病進(jìn)展和結(jié)局的因素之一[3]。近年來發(fā)現(xiàn)，由17型T輔助細(xì)胞（Th17細(xì)胞）產(chǎn)生的白細(xì)胞介素-17（IL-17）在心肌炎的急性和慢性病毒感染階段均明顯增多，提示在病毒性心肌炎發(fā)病過程中，IL-17作為重要的促炎細(xì)胞因子也參與了炎癥反應(yīng)[4-5]。

法舒地爾（fasudil）作為目前唯一批準(zhǔn)用于臨床的Rho激酶抑制劑，在防治蛛網(wǎng)膜下腔出血后的腦血管痙攣方面安全有效。近年來心血管病研究發(fā)現(xiàn)，法舒地爾可通過阻斷RhoA/ROCK信號(hào)通路，與多種細(xì)胞因子、炎癥因子及血管活性因子相互作用，在治療心肌肥大、心力衰竭、冠狀動(dòng)脈痙攣、心絞痛、心肌梗死等方面應(yīng)用前景廣闊[6]。然而，國內(nèi)外鮮有法舒地爾對CVB3感染后急性病毒性心肌炎影響的報(bào)道。本研究探討法舒地爾對CVB3病毒性心肌炎小鼠的作用及可能的機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞和病毒株 4周齡SPF級雄性BALB/c小鼠，體重（16.3±1.3）g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。CVB3（Nancy株）購自美國ATCC公司。病毒經(jīng)Hep2細(xì)胞（上海生化細(xì)胞所）活化增殖，滴度為107TCID50/0.1ml。

1.2 主要藥品與試劑 鹽酸法舒地爾（商品名：川威，分子式：C14H17N3O2S·HCl，國藥準(zhǔn)字 H20040356，批號(hào)：1606241，規(guī)格：2ml∶30mg）購自天津紅日藥業(yè)。Trizol總RNA提取液和PVDF膜購自美國Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄和常規(guī)PCR試劑盒購自加拿大Fermentas公司。兔抗小鼠IL-17單克隆抗體、兔抗小鼠ROCK2抗體購自美國Santa Cruz公司。IL-17 ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司，測量靈敏度為15pg/ml。血清乳酸脫氫酶和肌酸激酶微量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生存率實(shí)驗(yàn) 將80只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，分別為病毒性心肌炎組、低劑量法舒地爾治療組、法舒地爾治療組及正常對照組，每組20只，先進(jìn)行生存率實(shí)驗(yàn)。設(shè)接種病毒日為第0天，病毒性心肌炎組、低劑量法舒地爾治療組和法舒地爾治療組經(jīng)腹腔注射100TCID50/0.1的CVB3病毒稀釋液0.1ml[7]，正常對照組經(jīng)腹腔注射不含病毒的DMEM病毒培養(yǎng)液。在接種病毒次日（第1天）起，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[8]，分別每日給予低劑量法舒地爾治療組、法舒地爾治療組5mg/kg、10mg/kg腹腔注射，共14d，病毒性心肌炎組和正常對照組每日腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液作為對照至第14天。觀察上述4組小鼠生存率，并于第7天時(shí)用微量檢測試劑盒檢測4組小鼠的血清乳酸脫氫酶（LDH）和肌酸激酶（CK），協(xié)助判斷建模是否成功。由于生存率實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示低劑量法舒地爾治療組小鼠生存率較病毒性心肌炎組無明顯改善，故后續(xù)正式實(shí)驗(yàn)取消設(shè)置低劑量法舒地爾治療組。

1.3.2 正式實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型分組、制備及計(jì)算心臟重量/身體重量（HW/BW比值） 重新選擇同批次90只小鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為病毒性心肌炎組、法舒地爾治療組（每日10mg/kg腹腔注射，共14d）和正常對照組，每組30只，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，分別于第7、14天從各組抽取8只小鼠稱重，再行超聲心動(dòng)圖檢查后抽血和取心臟標(biāo)本（心臟稱重后沿中線切為兩半，一半經(jīng)10%甲醛溶液固定后行病理組織學(xué)檢查，另一半液氮速凍后保存在-80℃冰箱備用，做RT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測），分別計(jì)算第7、14天小鼠的HW/BW比值。

1.3.3 超聲心動(dòng)圖檢查 小鼠給予3%水合氯醛（0.01ml/g）腹膜內(nèi)注射麻醉成功，胸部備皮，取左側(cè)臥位，使用Agilent Sonos 5500超聲儀配備12MHz高頻線陣探頭，采用標(biāo)準(zhǔn)胸骨旁左心室長軸及短軸二維切面，測左心室舒張末期直徑（LVEDd）和左心室收縮末期直徑（LVESd），計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和短軸縮短率（FS）。上述指標(biāo)取3個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期的平均值。

1.3.4 病理組織學(xué)檢查 將10%甲醛溶液固定的心臟做厚約4μm常規(guī)石蠟切片并進(jìn)行HE染色，每張切片取5個(gè)視野，光鏡下觀察心肌組織病理改變，心肌組織病理學(xué)評分由兩名醫(yī)生分別判斷后取平均值。具體評判標(biāo)準(zhǔn)參照Rezkalla方法[9]計(jì)為：無病變?yōu)?分；病變（炎癥細(xì)胞浸潤、心肌壞死）占每張心臟切片視野面積≤25%為1分；＞25%～50%為2分；＞50%～75%為3分；＞75%為4分。

1.3.5 檢測小鼠心肌 CVB3、ROCK2和 IL-17的mRNA的表達(dá) 取心肌組織剪碎勻漿，采用Trizol一步法抽提心肌總RNA，測定OD260/OD280的比值鑒定RNA質(zhì)量。取總RNA2μg，采用Biotool逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取10μl反應(yīng)產(chǎn)物，再行2%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用ImageJ軟件處理，以β-actin作為內(nèi)參照，計(jì)算CVB3、ROCK2和IL-17 mRNA的相對表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 3min，變性95℃ 30s，退火30s，延伸72℃ 60s，72℃終末延伸5min后終止反應(yīng)，詳見表1。

表1 引物序列、退火溫度、循環(huán)次數(shù)及產(chǎn)物長度

1.3.6 測定心肌IL-17、ROCK2蛋白相對含量 將心肌組織研磨勻漿后提取總蛋白，進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，常規(guī)制備SDS-PAGE膠電泳后、轉(zhuǎn)移至PVDF膜、一抗封閉分別加入IL-17一抗（1∶500稀釋）、ROCK2一抗（1∶500稀釋）及 β-actin一抗（1∶2 500稀釋），然后4℃孵育過夜，二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育1h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，KwikQuantTM照相系統(tǒng)拍照并分析，以β-actin作為內(nèi)參照，用ImageJ軟件測量灰度值，計(jì)算IL-17及ROCK2蛋白相對量。

1.3.7 檢測血清IL-17水平 血液樣本離心后提取上層血清，采用雙抗體夾心ELISA法測定各組小鼠血清IL-17水平，所有操作嚴(yán)格按試劑盒說明書由專人進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 6.0和SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，若方差齊，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。若方差不齊則采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠的生存率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 病毒性心肌炎組小鼠從第2～3天開始陸續(xù)出現(xiàn)進(jìn)食減少、少動(dòng)、拱背、精神淡漠、易激惹、相互撕咬等癥狀，于第4天開始死亡，第7天時(shí)小鼠血清LDH、CK明顯升高（數(shù)據(jù)未顯示），提示建模成功。法舒地爾治療組小鼠則上述癥狀明顯減輕，正常對照組小鼠無死亡且精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)均正常。4組小鼠的生存率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

圖1 4組小鼠的生存率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖1可見，第14天時(shí)，病毒性心肌炎組、低劑量法舒地爾治療組、法舒地爾治療組生存率分別為45%（9/20）、55%（11/20）、75%（15/20），低劑量法舒地爾治療組小鼠生存率較病毒性心肌炎組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而法舒地爾治療組生存率較病毒性心肌炎組顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 3組小鼠第7和14天HW/BW比值與心肌組織病理學(xué)評分比較 見表2。

由表2可見，病毒性心肌炎組第7天與第14天HW/BW比值均較高于正常對照組，法舒地爾治療組HW/BW比值低于病毒性心肌炎組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與病毒性心肌炎組比較，法舒地爾組心肌切片炎癥細(xì)胞浸潤、心肌壞死明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。正常對照組心肌未發(fā)現(xiàn)病理改變。3組小鼠第7天與第14天心肌病理組織學(xué)變化見圖2（見封三）。

圖2 第7天與14天各組小鼠心肌病理組織學(xué)變化（A：病毒性心肌炎組第7天，B：病毒性心肌炎組第14天，C：法舒地爾治療組第7天，D：法舒地爾治療組第14天，E：正常對照組第7天；F：正常對照組第14天，均為H E染色，×200）

表2 3組小鼠第7和14天HW/BW比值與心肌組織病理學(xué)評分比較

2.3 3組小鼠第7天與第14天超聲心動(dòng)圖測量結(jié)果比較 見表3。

表3 3組小鼠第7天與第14天超聲心動(dòng)圖測量結(jié)果比較

由表3可見，與正常對照組比較，第7和14天時(shí)病毒性心肌炎組小鼠LVEDd和LVESd明顯增大，LVEF和FS均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）而給予法舒地爾治療組第14天后，上述指標(biāo)較病毒性心肌炎組均明顯改善，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 3組小鼠心肌組織 CVB3、ROCK2和 IL-17mRNA相對表達(dá)量的比較 見圖3。

圖3 3組小鼠心肌組織 CVB3、ROCK2和 IL-17mRNA 相對表達(dá)量的比較（A：CVB3 mRNA；B：ROCK2 mRNA；C：IL-17mRNA，注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與病毒性心肌炎組比較，△P＜0.05）

由圖3可見，病毒性心肌炎組第14天的CVB3mRNA相對表達(dá)量低于第7天的CVB3mRNA相對表達(dá)量。法舒地爾治療組第7、14天CVB3mRNA相對表達(dá)量均低于病毒性心肌炎組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。病毒性心肌炎組ROCK2mRNA和IL-17mRNA表達(dá)均高于正常對照組，其中，第7天ROCK2mRNA水平高于第14天，IL-17mRNA表達(dá)水平在第7天明顯低于第14天。法舒地爾治療組第7、14天心肌組織ROCK2mRNA、IL-17mRNA水平均較病毒性心肌炎組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.5 3組小鼠心肌組織ROCK2、IL-17蛋白含量和外周血IL-17水平比較 見圖4。

圖4 3組小鼠心肌組織ROCK2、IL-17蛋白含量和外周血IL-17水平比較（A：ROCK2蛋白；B：IL-17蛋白；C：外周血IL-17水平；注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與病毒性心肌炎組比較，△P＜0.05）

由圖4可見，第7天和第14天，病毒性心肌炎組小鼠心肌組織ROCK2、IL-17蛋白含量、IL-17水平均高于正常對照組，法舒地爾治療組小鼠心肌組織ROCK2、IL-17蛋白含量和血清IL-17水平均明顯低于病毒性心肌炎組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

本研究表明，法舒地爾減輕了病毒性心肌炎小鼠的心肌炎癥損傷，可能與阻斷RhoA/ROCK信號(hào)通路，下調(diào)炎癥細(xì)胞因子IL-17水平有關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK信號(hào)通路在心肌肥大、缺血再灌注損傷、心肌細(xì)胞凋亡以及心肌纖維化時(shí)被激活，與多種細(xì)胞因子、炎癥因子及血管活性因子等相互作用，參與上述心血管疾病的病理生理過程[6]。例如，急性心肌梗死后小鼠心肌Rho激酶的活性增高，促進(jìn)多種促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，在心肌梗死后左心室重構(gòu)中發(fā)揮重要作用，而每日口服法舒地爾100mg/kg 4周后能顯著抑制左心室重構(gòu)，提示Rho激酶可能是防治心肌梗死后心力衰竭的潛在靶點(diǎn)[10]。Bao等[11]發(fā)現(xiàn)在小鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)前1h預(yù)先使用Rho激酶抑制劑，能夠抑制缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，降低IL-6水平，減少心肌梗死面積，并保護(hù)心功能。雖然急性病毒性心肌炎和急性心肌梗死后左心室重構(gòu)及缺血再灌注損傷在病因和臨床特征方面表現(xiàn)迥異，但在發(fā)病后繼發(fā)的炎癥反應(yīng)和心肌損傷方面卻存在共同炎癥機(jī)制，近年來被統(tǒng)稱為炎癥性心臟病[12]。本研究表明，急性CVB3感染后小鼠心肌ROCK2 mRNA和蛋白含量表達(dá)均有升高，提示病毒感染激活了Rho激酶，而應(yīng)用法舒地爾抑制RhoA/ROCK信號(hào)通路后，CVB3復(fù)制減少，心肌病理損傷減輕，心肌炎小鼠生存率提高，心功能得到改善。

近年來，Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17被證明是加重CVB3感染后心肌炎發(fā)展的一大關(guān)鍵[4-5]。IL-17可促進(jìn)多種免疫細(xì)胞在炎癥部位聚集和炎癥因子的釋放[13]。例如，IL-17不但促進(jìn)心肌炎小鼠巨噬細(xì)胞分泌IL-1β及腫瘤壞死因子α（TNF-α）加重心肌損傷，還能抑制淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ[14]，而后者是公認(rèn)的能抑制病毒復(fù)制的細(xì)胞因子。此外，IL-17還可抑制CD8+T細(xì)胞來促進(jìn)病毒的復(fù)制，反之，應(yīng)用抗體中和IL-17能減少病毒性心肌炎小鼠病毒復(fù)制及心肌損傷[15]。研究證實(shí)，抑制RhoA/ROCK通路可降低多種免疫性疾病中IL-17的水平，如法舒地爾可抑制IL-17和TNF-α在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠模型中的表達(dá)[16]。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者口服選擇性ROCK2抑制劑后可減少IL-17的分泌高達(dá)60%以上，其機(jī)制可能與抑制ROCK2后減少了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）的磷酸化有關(guān)[17]。本研究證實(shí)，在急性病毒性心肌炎小鼠中，法舒地爾同樣能抑制IL-17表達(dá)，從而抑制CVB3復(fù)制和減輕心肌病理損傷和改善心功能。

目前國內(nèi)外少有法舒地爾治療急性CVB3病毒性心肌炎的相關(guān)研究。袁麗等[18]發(fā)現(xiàn)，法舒地爾對成年BALB/c小鼠巨細(xì)胞病毒性心肌炎有一定的治療作用，與本文結(jié)論一致。然而亦有報(bào)道，法舒地爾對腦心肌炎病毒感染的小鼠并無治療作用[19]，但筆者認(rèn)為該研究中法舒地爾治療組小鼠每日口服用量僅為10mg/kg，遠(yuǎn)少于既往多項(xiàng)陽性結(jié)果的研究中每日 100mg/kg 的口服劑量[10，16，19]。而相關(guān)研究證實(shí)，后者口服劑量與本研究采用每日10mg/kg腹腔注射給藥療效相當(dāng)[8]，從而支持本研究結(jié)論。

綜上所述,本研究初步證實(shí)，法舒地爾作為已上市并廣泛應(yīng)用的老藥，對CVB3誘發(fā)的急性病毒性心肌炎小鼠具有一定保護(hù)作用，這為急性病毒性心肌炎的治療開辟新的思路。但法舒地爾的確切治療效果還有待大量的臨床對照試驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。