許冬，王玲，叢勝波，王金濤，李文靜，萬鵬

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紅鈴蟲性信息素合成激活肽基因克隆、序列特征及在不同發(fā)育階段的表達(dá)分析

許冬，王玲，叢勝波，王金濤，李文靜，萬鵬

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所/農(nóng)業(yè)部華中作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)作物重大病蟲草害防控湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064）

【目的】克隆紅鈴蟲（）性信息素合成激活肽（pheromone biosynthesis activating neuropeptide，PBAN）基因，分析其序列特征，闡明該基因在紅鈴蟲不同發(fā)育階段中的表達(dá)規(guī)律，以及與交配行為、棉花揮發(fā)物間的調(diào)控關(guān)系，為進(jìn)一步揭示紅鈴蟲性信息素合成釋放機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。【方法】利用RACE技術(shù)克隆紅鈴蟲性信息素合成激活肽基因的全長(zhǎng)cDNA序列，應(yīng)用DNAMAN 6.0對(duì)其進(jìn)行序列分析，利用Protparam、Chou & Fasman等在線分析軟件進(jìn)行蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和生物信息學(xué)分析；利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)在紅鈴蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)規(guī)律，分析交配行為和棉花揮發(fā)物對(duì)表達(dá)水平的影響。【結(jié)果】獲得了全長(zhǎng)cDNA序列，Genbank登錄號(hào)為KY987647，該基因cDNA全長(zhǎng)1 461 bp，其開放閱讀框（ORF）為618 bp，編碼205個(gè)氨基酸，5′端非編碼區(qū)長(zhǎng)121 bp，3′端非編碼區(qū)長(zhǎng)722 bp；編碼的氨基酸序列包含了滯育激素、神經(jīng)肽、神經(jīng)肽、PBAN和神經(jīng)肽5種神經(jīng)肽，N端還含有一個(gè)23氨基酸的信號(hào)肽；預(yù)測(cè)該蛋白分子量為2.41 kD，等電點(diǎn)為9.25；同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，PgosPBAN與15種鱗翅目昆蟲的PBAN位于同一分支，其中與PgosPBAN進(jìn)化關(guān)系最近的是二化螟（）的PBAN（GenBank登錄號(hào)：ALM30314.1），表明這兩個(gè)基因可能有共同的祖先基因；在紅鈴蟲不同發(fā)育階段存在明顯的表達(dá)特異性，以成蟲期的表達(dá)量較高，幼蟲期次之，蛹期最低；在紅鈴蟲雌、雄成蟲體內(nèi)均有表達(dá)，且1—5 d內(nèi)雄性成蟲表達(dá)量顯著高于雌性成蟲；交配后1—3 d的紅鈴蟲體內(nèi)表達(dá)水平顯著高于處女蛾；暴露于棉花揮發(fā)物1—5 d雄成蟲表達(dá)水平未受到顯著影響，而1、8 d雌成蟲及8 d雄成蟲表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照?！窘Y(jié)論】明確了的核苷酸、氨基酸序列特征，分析了該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)特征。根據(jù)在紅鈴蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)規(guī)律以及與交配行為、棉花揮發(fā)物的調(diào)控關(guān)系，推測(cè)該基因不僅參與了紅鈴蟲雌性信息素的合成釋放，在調(diào)控雄性信息素以及調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育等方面可能也扮演著重要角色。

紅鈴蟲；性信息素合成激活肽；表達(dá)分析；交配行為；棉花揮發(fā)物

0 引言

【研究意義】紅鈴蟲（）是一種世界性的重要棉花害蟲，以幼蟲鉆入棉花的蕾、花、鈴等繁殖器官進(jìn)行危害。因其在組織外滯留時(shí)間短，導(dǎo)致各種傳統(tǒng)防治方法效果有限，給棉花的生長(zhǎng)造成嚴(yán)重?fù)p失。20世紀(jì)70年代末，美國(guó)成功研發(fā)出紅鈴蟲性信息素，并在生產(chǎn)應(yīng)用中取得良好效果[1]。我國(guó)也是較早利用紅鈴蟲性信息素開展蟲情監(jiān)測(cè)和害蟲防治的國(guó)家[2]。目前，各國(guó)在紅鈴蟲性信息素化學(xué)結(jié)構(gòu)、組分比例、田間應(yīng)用等方面作了大量研究[3]，但有關(guān)紅鈴蟲性信息素在蟲體內(nèi)的合成、釋放及作用的分子機(jī)制尚缺乏深入了解。蛾類昆蟲性信息素合成與釋放受其體內(nèi)性信息素合成激活肽（pheromone biosynthesis activating neuropeptide，PBAN）控制。該活性肽是一種C端具有FXPRL五肽序列的昆蟲神經(jīng)肽，除了與昆蟲性信息素合成釋放相關(guān)外，還在表皮色素控制、胚胎滯育以及刺激內(nèi)臟肌肉收縮等生理過程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。因此，研究PBAN在紅鈴蟲生長(zhǎng)發(fā)育、求偶交配及與寄主化學(xué)通訊過程中的表達(dá)規(guī)律，以揭示紅鈴蟲性信息素合成釋放的調(diào)控機(jī)制，可為進(jìn)一步探討棉花害蟲遺傳防治的新途徑，如設(shè)計(jì)具有激活或抑制作用的類似物，研制高效、專一性強(qiáng)、無公害的性信息素提供思路[6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】大多數(shù)蛾類昆蟲的性信息素釋放具有明顯的晝夜節(jié)律性，而昆蟲性信息素合成激活神經(jīng)肽PBAN是控制其合成和釋放的最主要調(diào)控因子[7]。PBAN最初從谷實(shí)夜蛾（）中分離得到，后陸續(xù)又在棉鈴蟲（）[8]、煙草天蛾（）[9]、家蠶（）[10]、水稻二化螟（）[11]、小菜蛾（）[12]、分月扇舟蛾（）[13]等多種鱗翅目昆蟲中以及雙翅目昆蟲埃及伊蚊（）[14]中克隆鑒定。PBAN主要是通過影響合成途徑中不同的關(guān)鍵酶，最終導(dǎo)致這些反應(yīng)的不同組合產(chǎn)生各種昆蟲所特有的信息素混合物。Tsfadia等[15]研究了印度谷螟（）和棉鈴蟲的酶抑制劑對(duì)性信息素的生物合成途徑及限制速率，證實(shí)PBAN可對(duì)性腺分泌的乙酰輔酶A產(chǎn)生影響，并通過刺激脂肪酸合成酶系中的乙酰輔酶A羧化酶來增加其活性，進(jìn)而促使性信息素合成[7,15]。但目前的研究顯示，不同物種中PBAN的調(diào)控機(jī)制有所不同，如玉米螟PBAN可通過增加脂肪酸生物合成時(shí)的底物來調(diào)控信息素生物合成，而家蠶體內(nèi)PBAN的作用卻是減少脂肪酸生物合成時(shí)的底物供應(yīng)[16-17]。值得注意的是，PBAN對(duì)蛾類性信息素的調(diào)節(jié)不僅僅局限在雌蟲中，隨后的研究表明PBAN在雄性個(gè)體中也有表達(dá)，并且在雄性信息素產(chǎn)生中起著關(guān)鍵作用[18]。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PBAN并不是調(diào)控性信息素合成的唯一物質(zhì)，在一些昆蟲中，保幼激素（juvenile hormone，JH）和章魚胺（octopamine，OA）對(duì)調(diào)控性信息素也起著一些作用[19-20]。RafAeli等學(xué)者認(rèn)為保幼激素可通過控制PBAN的釋放進(jìn)而控制信息素的生物合成，并且能夠控制PBAN等進(jìn)入血淋巴，進(jìn)而調(diào)控其體色多態(tài)現(xiàn)象[21]。RafAeli等在細(xì)胞水平揭示章魚胺在刺激產(chǎn)生性信息素的過程中起到中間傳遞信息的作用，它能與PBAN相互作用抑制性信息素生物合成[22]。研究還發(fā)現(xiàn)，大多鱗翅目害蟲PBAN的轉(zhuǎn)錄前體除了編碼PBAN外，還可編碼-神經(jīng)肽、-神經(jīng)肽、滯育激素（diapause hormone，DH）以及-神經(jīng)肽等[23]。如PBAN編碼的滯育激素在有的昆蟲蛹滯育期可作用于卵巢誘導(dǎo)其胚胎滯育，而在另外一些昆蟲體內(nèi)卻能縮短滯育時(shí)期甚至打破滯育[24]，甚至有些昆蟲PBAN的多肽序列還包含了黑化作用和紅化作用激素，可在幼蟲階段對(duì)表皮起黑化作用，成蟲發(fā)育過程調(diào)節(jié)信息素生物合成[25]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】紅鈴蟲性信息素已被應(yīng)用于棉花害蟲綠色防控，但紅鈴蟲本身性信息素合成釋放的機(jī)制尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確紅鈴蟲PBAN基因（）序列特征及其在不同發(fā)育階段的表達(dá)規(guī)律，探索昆蟲交配行為及棉花揮發(fā)物對(duì)表達(dá)水平的影響，為闡明紅鈴蟲性信息素合成、釋放機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年5月至2018年6月在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所完成。

1.1 試驗(yàn)材料

紅鈴蟲為敏感品系，于2003年采自湖北省潛江地區(qū)（N 30°20′55.63″、E 112°55′58.41″）棉田，經(jīng)筆者實(shí)驗(yàn)室人工飼料連續(xù)飼養(yǎng)，期間不接觸任何農(nóng)藥。供試紅鈴蟲幼蟲在（27±1）℃、相對(duì)濕度50%左右的養(yǎng)蟲間飼養(yǎng)，自然光照。待其化蛹后，將其置于光照培養(yǎng)箱中，溫度（27±1）℃，相對(duì)濕度70%左右，光周期L﹕D=14 h﹕10 h。

鄂棉24為常規(guī)棉，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所棉花病蟲害課題組提供。于2016年5月上旬種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)田中，N 30°28′53.33″、E114°18′40.24″。

1.2 PgosPBAN全長(zhǎng)cDNA克隆

1.2.1cDNA片段序列擴(kuò)增 紅鈴蟲總RNA提取采用TRIzol法，提取試劑盒購(gòu)自Invitrogen。反轉(zhuǎn)錄參考Promega公司的Reverse Transcription System試劑盒說明書進(jìn)行。利用DNAMAN Version 6軟件，分析已經(jīng)報(bào)道的鱗翅目害蟲PBAN的氨基酸序列，根據(jù)保守區(qū)結(jié)合密碼子偏好特性，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)兼并引物-F、-R（表1），以合成的cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系：10× LA taq buffer 2.5 μL，dNTPMix（2.5 mmol·L-1each）2 μL，LA taq 0.25 μL，正反引物各1.25 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 15.75 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶用Gel Extraction Kit凝膠回收試劑盒回收純化。后連接到T-easy克隆載體，轉(zhuǎn)化到Dh5感受態(tài)細(xì)胞，涂布到含有氨芐青霉素（Amp）的LB固體培養(yǎng)基。37℃培育過夜，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白色單菌落放入含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r/min培養(yǎng)12 h。經(jīng)菌液PCR驗(yàn)證，將目的條帶大小合適的菌液采用質(zhì)粒提取試劑盒（AXYGEN）提取質(zhì)粒，并送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.23′和5′-末端cDNA序列擴(kuò)增 設(shè)計(jì)目的基因序列片段外側(cè)和內(nèi)側(cè)特異性引物，采用TaKaRa RACE試劑盒擴(kuò)增該基因3′和5′-末端cDNA序列。擴(kuò)增產(chǎn)物處理方法同上，測(cè)序得到目的基因3′和5′-末端cDNA序列片段，用DNAMAN軟件拼接得到目的基因全長(zhǎng)cDNA序列，最后再根據(jù)所拼接序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增全長(zhǎng)的PCR驗(yàn)證。

1.3 PgosPBAN序列分析、進(jìn)化樹構(gòu)建和蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用生物信息學(xué)在線工具Protparam（https://web. expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)蛋白理論分子量、等電點(diǎn)、親脂性；利用SignaIP 4.1 Serve（http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽；蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)利用Chou & Fasman二級(jí)結(jié)構(gòu)服務(wù)器進(jìn)行預(yù)測(cè)；跨膜預(yù)測(cè)分析（http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/，TMHMM）；利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）的BLASTx程序搜索序列同源相似性；采用DANMAN V6軟件比對(duì)蛋白序列的同源相似性；采用MEGA7.0軟件構(gòu)建蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，用鄰接法（neighbor-joining，NJ）并經(jīng)bootstrap重復(fù)1 000次抽樣分析。

1.4 PgosPBAN在紅鈴蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)

分別選取5日齡幼蟲12頭、10日齡（4齡幼蟲）幼蟲5頭、1日齡和5日齡蛹各5頭，以及羽化0 d（羽化當(dāng)天）、1、3、5、8 d的雌、雄成蟲各5頭用于表達(dá)量測(cè)定，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法[26]。熒光定量PCR（qRT-PCR）反應(yīng)體系：SYBR? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（2X）10 μl，上、下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，無RNA酶水7 l。采用兩步法PCR標(biāo)準(zhǔn)法，擴(kuò)增程序：95℃2 min；95℃5 s，60℃30 s，共40個(gè)循環(huán)。以紅鈴蟲的為內(nèi)參基因，采用Primer 5.0軟件分別設(shè)計(jì)目的基因和內(nèi)參基因引物（表1）。將含有目的基因和內(nèi)參基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品與不同發(fā)育階段的紅鈴蟲樣品，在同一96孔板上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每處理設(shè)5個(gè)生物學(xué)重復(fù)及3個(gè)技術(shù)重復(fù)，以無菌水為對(duì)照。根據(jù)目的和內(nèi)參基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲取基因的拷貝數(shù)含量，通過內(nèi)參基因的均一化處理計(jì)算紅鈴蟲各處理中目的基因相對(duì)于內(nèi)參基因的表達(dá)量。同時(shí)，以羽化當(dāng)天（0 d）雌蟲表達(dá)量為標(biāo)準(zhǔn)定量，計(jì)算紅鈴蟲不同發(fā)育階段基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 PgosPBAN擴(kuò)增所用引物

1.5 交配行為對(duì)PgosPBAN表達(dá)的影響

選取剛羽化的紅鈴蟲處女蛾，按性比1﹕1的比例，將紅鈴蟲雌、雄成蟲放置于塑料產(chǎn)卵罐中（直徑10 cm，高15 cm），產(chǎn)卵罐頂端用50目的紗網(wǎng)覆蓋，底端密封，內(nèi)置10%的蜂蜜水和供紅鈴蟲成蟲休息、隱藏的折疊紙片。在首個(gè)暗期處理8 h時(shí)，用微紅光源每隔0.5 h觀察一次交配情況。選取有交配行為的成蟲作為試驗(yàn)用蟲。在首次交配后第1個(gè)和第3個(gè)暗期3 h左右，取紅鈴蟲雌、雄成蟲各5頭，用于測(cè)定紅鈴蟲雌、雄成蟲體內(nèi)表達(dá)量，重復(fù)4次。基因表達(dá)量測(cè)定方法同1.4。

1.6 棉花揮發(fā)物對(duì)PgosPBAN表達(dá)的影響

選取剛羽化的紅鈴蟲處女雌、雄蛾，分別放置于不同的產(chǎn)卵罐后，將其置于四周放置有棉苗（5—7葉期）的封閉塑料盒中（40 cm×50 cm）飼養(yǎng)，以不放棉苗處理作為對(duì)照。設(shè)置處理時(shí)間為1、3、5、8 d。每重復(fù)取5頭成蟲，重復(fù)4次。待各處理時(shí)間到達(dá)后，將處理的雌、雄成蟲取出，用于測(cè)定表達(dá) 量。測(cè)定方法同1.4。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)紅鈴蟲不同發(fā)育階段內(nèi)表達(dá)量進(jìn)行方差分析，采用One-way ANOVA用于顯著性檢驗(yàn)，多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差法分析（＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 PgosPBAN全長(zhǎng)cDNA克隆及序列分析

通過RACE技術(shù)擴(kuò)增獲得cDNA全長(zhǎng)序列（Genbank登錄號(hào)：KY987647）。該序列全長(zhǎng)1 461 bp，其中開放閱讀框（ORF）618 bp，編碼205個(gè)氨基酸。5′端的非翻譯區(qū)（5′-UTR：untranslated regions）長(zhǎng)121 bp，3′-UTR長(zhǎng)722 bp。根據(jù)基因拼接結(jié)果的序列設(shè)計(jì)特異性引物，以紅鈴蟲幼蟲和成蟲混合的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，可以克隆到ORF區(qū)的cDNA全長(zhǎng)序列（圖1），且電泳條帶與預(yù)測(cè)片段大小一致。

M：DL2000 DNA marker；1：PgosPBAN ORF區(qū)PCR產(chǎn)物PCR products of the coding sequence of PgosPBAN

以SignalP 4.0推導(dǎo)出蛋白序列后，發(fā)現(xiàn)其N端有一條潛在的信號(hào)肽：M1-A23，緊隨后面的是DH類似肽（S24-W54）。同時(shí)，全長(zhǎng)序列中含有6個(gè)典型的識(shí)別切割位點(diǎn)，分別為G55-K56-R57、K102-K103、G111-R112、G135-R136-R137、G171-P172和G181- R182。根據(jù)基因的剪切位點(diǎn)，找到了該基因編碼的5個(gè)神經(jīng)肽，分別為滯育激素、-食下神經(jīng)節(jié)（-SGNP，V104-L110）、-食下神經(jīng)節(jié)（-SGNP，S113-L134）、PBAN（L138-L170）以及-食下神經(jīng)節(jié)（-SGNP，N173-L180）。每個(gè)神經(jīng)肽的C末端都有FXPR/KL序列。

利用生物信息學(xué)在線工具Protparam分析氨基酸序列，該蛋白的預(yù)測(cè)分子量為2.41 kD；等電點(diǎn)為9.25；含酸性氨基酸（Asp+Glu）31個(gè)，占15.2%，堿性氨基酸（Arg+Lys）36個(gè)，占17.6%；分子式為C1073H1670N308O314S5；不穩(wěn)定系數(shù)為46.84；脂肪指數(shù)為69.46，總平均疏水指數(shù)為-0.773。TMHMM顯示，該蛋白為非跨膜蛋白，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成為13.2%的H（-helix）、10.2%的E（-sheet）、76.6%的C（loop或coil）。

2.2 PgosPBAN氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

采用MEGA 7.0的鄰接法對(duì)4個(gè)目16科23種昆蟲PBAN構(gòu)建了進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果表明，PgosPBAN與15種鱗翅目昆蟲的PBAN位于同一分支。其中與PgosPBAN進(jìn)化關(guān)系最近的是二化螟的PBAN（GenBank登錄號(hào)：ALM30314.1），表明這兩個(gè)基因可能有共同的祖先基因；其次是甜菜夜蛾（，GenBank登錄號(hào)：AAT64424.1）、斜紋夜蛾（，GenBank登錄號(hào)：AJT60314.1）等其他科14種鱗翅目害蟲，表明PgosPBAN與大多鱗翅目昆蟲PBAN的親緣關(guān)系較近。PgosPBAN與鞘翅目的光肩星天牛（，GenBank登錄號(hào)：XP_018561338.1）、赤擬谷盜（，GenBank登錄號(hào)：XP_015835244.1）以及雙翅目媒斑蚊（，GenBank登錄號(hào)：JAV30566.1）、膜翅目阿里山潛蠅繭蜂（，GenBank登錄號(hào)：XP_011298848.1）的PBAN位于不同分支上，其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 PgosPBAN在不同發(fā)育階段的表達(dá)水平

采用qRT-PCR方法，以羽化當(dāng)天的處女雌蛾的表達(dá)量為基準(zhǔn)，分析了紅鈴蟲不同發(fā)育階段表達(dá)水平。結(jié)果表明，在紅鈴蟲不同發(fā)育階段存在表達(dá)特異性，其中在成蟲期的表達(dá)量較高。羽化1 d的處女雌、雄成蟲，相對(duì)表達(dá)量分別為標(biāo)準(zhǔn)參量的4.3和10.0倍，羽化8 d則分別為11.7和13.8倍。可見，在紅鈴蟲雌、雄成蟲體內(nèi)均有表達(dá)，且雄性成蟲1—5 d的相對(duì)表達(dá)量顯著高于雌成蟲。在幼蟲期表達(dá)量相對(duì)較低，其中，5 d的幼蟲比10 d的相對(duì)表達(dá)量高，分別為6.9和2.3倍。在蛹期相對(duì)表達(dá)量最低，5 d雌、雄蛹的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.06和0.20倍（圖3）。

圖2 PBAN蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖3 PgosPBAN在紅鈴蟲不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量

2.4 交配行為對(duì)不同發(fā)育階段PgosPBAN表達(dá)的影響

通過比較紅鈴蟲成蟲在交配前后表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)有交配行為的紅鈴蟲雌、雄成蟲在交配后1 d（首次交配后13 h）和交配后3 d時(shí)的表達(dá)量都高于未交配處理。其中，在首次交配后13 h，雌、雄成蟲體內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量分別是標(biāo)準(zhǔn)參量的8.9和22.0倍，而未交配的處女雌、雄成蟲體則僅為4.3和10.0倍，顯著低于交配處理（圖4）。

圖4 交配行為對(duì)紅鈴蟲成蟲PgosPBAN表達(dá)量的影響

2.5 棉花揮發(fā)物對(duì)紅鈴蟲成蟲PgosPBAN的影響

通過分析棉花揮發(fā)物對(duì)紅鈴蟲表達(dá)水平的影響發(fā)現(xiàn)，1—5 d雄成蟲表達(dá)水平未受到棉花寄主揮發(fā)物顯著影響，而棉花揮發(fā)物處理后1、8 d雌成蟲及8 d雄成蟲表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照處理（圖5）。

圖5 棉花揮發(fā)物對(duì)紅鈴蟲成蟲PgosPBAN表達(dá)量的影響

3 討論

大多數(shù)昆蟲編碼的5個(gè)神經(jīng)肽都非常保守，而大部分氨基酸殘基存在較大的變異多樣性[27]，這為遺傳改造、干擾成蟲交配以及開發(fā)高選擇性或廣譜性的PBAN類似物用于綠色防控開拓了思路[28]。本研究鑒定了，其cDNA全長(zhǎng)序列包含6個(gè)識(shí)別切割位點(diǎn)，編碼5個(gè)神經(jīng)肽，且C末端都含有FXPR/KL序列，具有典型的PBAN結(jié)構(gòu)。同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，PgosPBAN與大多鱗翅目昆蟲的PBAN位于同一個(gè)分支，其中與PgosPBAN進(jìn)化關(guān)系最近的是二化螟PBAN，表明這兩個(gè)基因可能有共同的祖先基因。

在紅鈴蟲不同發(fā)育階段中存在明顯的表達(dá)特異性。其中，成蟲期的相對(duì)表達(dá)量最高，幼蟲期次之，蛹期最低。這與甜菜夜蛾、斜紋夜蛾等昆蟲的發(fā)育表達(dá)模式相似[29-30]，與煙草天蛾等昆蟲的發(fā)育表達(dá)模式則完全不同[9]。PBAN在紅鈴蟲幼蟲期和蛹期可能僅行使了部分功能。有研究顯示，PBAN編碼的滯育激素在部分昆蟲的幼蟲期可行使推遲若蟲進(jìn)入成熟期的時(shí)間、促使若蟲群體發(fā)育整齊及調(diào)節(jié)若蟲體色變化等功能[30]，在蛹期則可能存在刺激蛹發(fā)育和解除滯育的功能[31]。成蟲期，表達(dá)量表現(xiàn)出隨著日齡增大逐漸升高的趨勢(shì)，暗示其在此時(shí)期可能已開啟性信息素的合成功能，為分泌大量性信息素合成其相關(guān)前體物質(zhì)[32]。此結(jié)果與紅鈴蟲羽化前期具有旺盛的交配能力相吻合。雖然本試驗(yàn)只能在mRNA水平而不是在蛋白水平直接證明在紅鈴蟲成蟲1—8 d內(nèi)呈上升趨勢(shì)，但結(jié)合紅鈴蟲求偶行為的研究結(jié)果（未發(fā)表），處女蛾在羽化前期（1—13 d）的暗期求偶持續(xù)時(shí)間也隨日齡的增加而上升，表明其求偶行為與表達(dá)量有密切的聯(lián)系，這在一些昆蟲中已有詳細(xì)的研究[33-34]。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，與美洲棉鈴蟲[18]等昆蟲相似，表達(dá)不局限于紅鈴蟲雌蟲，其雄蟲體內(nèi)也有較高水平表達(dá)，且表達(dá)量高于雌蟲，說明在紅鈴蟲雄性性信息素合成釋放以及生長(zhǎng)發(fā)育等生理過程可能也發(fā)揮著重要作用。有研究顯示，大多數(shù)昆蟲雄蛾性信息素主要是近距離激發(fā)雌蟲性欲，抑制同種其他雄蟲前來交配[35-36]。本試驗(yàn)將多頭雌、雄成蟲置于同一容器中，雄蛾個(gè)體間為了趨避同種、避免交配競(jìng)爭(zhēng)勢(shì)必會(huì)刺激合成PBAN，從而產(chǎn)生更多的性信息素來吸引雌性。PBAN與雄性信息素間的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。

交配行為是影響性信息素以及PBAN合成釋放的一個(gè)重要因素。有研究顯示，大多數(shù)昆蟲交配后，其體內(nèi)PBAN短期內(nèi)會(huì)先受到顯著抑制后又逐漸恢復(fù)[30,37-38]。但有的昆蟲交配后，性信息素合成釋放短時(shí)間內(nèi)雖會(huì)受到抑制，但體內(nèi)性腺的活性以及PBAN在食下神經(jīng)節(jié)內(nèi)的合成并不受影響[39]。說明交配行為對(duì)不同昆蟲PBAN合成釋放的調(diào)控影響差異較大。本研究結(jié)果顯示，紅鈴蟲雌、雄成蟲在交配處理后1 d和3 d，其體內(nèi)相對(duì)表達(dá)量均顯著高于處女蛾，證實(shí)交配行為對(duì)1—3 d紅鈴蟲成蟲的調(diào)控作用顯著。鑒于相對(duì)表達(dá)量與性信息素含量變化往往呈反比[18]，筆者推測(cè)紅鈴蟲處女蛾為了交配成功，可能會(huì)加大合成釋放性信息素，從而導(dǎo)致其體內(nèi)前體物質(zhì)PBAN的大量損耗，而有交配行為的紅鈴蟲，對(duì)再次交配的投入會(huì)相應(yīng)減少，其體內(nèi)合成釋放PBAN的速率也會(huì)受到抑制。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)棉花揮發(fā)物對(duì)存在一定的調(diào)控作用。暴露于棉花揮發(fā)物1—5 d雄成蟲表達(dá)水平未受到顯著影響，而1、8 d雌成蟲及8 d雄成蟲表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照。這與植物揮發(fā)物對(duì)小菜蛾的調(diào)控機(jī)制相似。有研究顯示，暴露于植物揮發(fā)物異硫氰酸丙烯酯的小菜蛾在羽化后18 h和60 h時(shí)表達(dá)量均顯著低于對(duì)照處理[40]。說明寄主植物揮發(fā)物對(duì)昆蟲PBAN合成及性信息素釋放存在一定的調(diào)控及刺激作用。對(duì)于紅鈴蟲羽化后期成蟲，棉花揮發(fā)物可能會(huì)激發(fā)其對(duì)性信息素的積極行為，通過這種增效及補(bǔ)償機(jī)制以達(dá)到成功交配，但勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致紅鈴蟲體內(nèi)大量前體物質(zhì)的損耗。

4 結(jié)論

利用RACE技術(shù)分離得到全長(zhǎng)序列1 461 bp，ORF為618 bp，編碼205個(gè)氨基酸，且N端有一條潛在的信號(hào)肽。該基因含有6個(gè)保守的識(shí)別切割位點(diǎn)，編碼5個(gè)神經(jīng)肽，每個(gè)神經(jīng)肽的C末端都有FXPR/KL序列，其編碼的蛋白與大多鱗翅目昆蟲具有高度同源性。在紅鈴蟲不同發(fā)育階段存在明顯的表達(dá)特異性。表達(dá)不局限于紅鈴蟲雌蛾，雄性個(gè)體也有大量表達(dá)，且表達(dá)量高于雌蛾。根據(jù)在紅鈴蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)規(guī)律以及與交配行為、棉花揮發(fā)物的調(diào)控關(guān)系，推測(cè)該基因不僅參與了紅鈴蟲雌性信息素的合成釋放，在調(diào)控雄性信息素以及調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育等方面可能也扮演著重要角色。

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Cloning, Sequence Analysis and Expression of Pheromone Biosynthesis Activating Neuropeptide (PBAN) Gene in Different Development Stages of

XU Dong, WANG Ling, CONG ShengBo, WANG JinTao, LI WenJing, WAN Peng

(Institute of Plant Protection and Soil Science, Hubei Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Central China, Ministry of Agriculture/Hubei Key Laboratory of Crop Disease, Insect Pests and Weeds Control, Wuhan 430064)

【Objective】The objective of this study is to clone the pheromone biosynthesis activating neuropeptide (PBAN) gene of pink bollworm (), analyze its sequence characteristics, clarify its expression patterns in different developmental stages as well as correlation with mating behavior and cotton volatiles, which will provide a scientific basis for further revealing the biosynthesis and release mechanisms of sex pheromone in.【Method】The full cDNA sequence ofwas cloned by RACE technique. Gene splicing and amino acid sequence were analyzed by the software of DNAMAN 6.0, protein secondary structure prediction ofand bioinformatics information were predicted using Protparam and Chou & Fasman. The expression patterns ofin different developmental stages ofwere detected and the effects of mating behavior and cotton volatiles on the expression level ofwere analyzedusing real-time quantitative PCR (qRT-PCR). 【Result】The full cDNA sequence of(Genbank accessionnumber: KY987647) is obtained, and the total length of cDNA is 1 461 bp. The open reading frame (ORF) is 618 bp, encoding 205 amino acid residues. The length of 5′-untranslated region (5′ UTR) and 3′-untranslated region (3′ UTR) is 121 and 722 bp, respectively. The amino acid sequence encoded bycontains five peptides, including diapause hormone homolog,-SGNP,-SGNP, PBAN and-SGNP, and a signal peptide of 23 amino acid residues at the N terminus. The predicted molecular mass and isoelectric point are 2.41 kD and 9.25, respectively. Homology and phylogenetic tree analysis showed that PgosPBAN and PBAN of 15 Lepidoptera insects were located in the same branch, and PgosPBAN had the closest relationship withPBAN (GenBank accessionnumber: ALM30314.1), suggesting that the two genes likely developed from a common ancestral gene.The expression ofwas specific in different developmental stages, which was higher in adult stage, second in larval stage, and the lowest in pupal stage.was expressed in both female and male adults,and the expression ofin male adults was significantly higher than that in female adults from the 1st-day to 5th-day old. The expression level ofinat 1-3 days after mating was significantly higher than that in virgin moth. After exposed to cotton volatiles for 1-5 days, the expression level ofin male adults had no significant difference compared with the control, but the expression level ofat 1st, 8th day of female adults and 8th day of male adults was significantly lower than that in control. 【Conclusion】The sequence characteristics of nucleotides and amino acids ofwere clarified, and the secondary structure characteristics of the proteinwere analyzed. According to the expression ofin different developmental stages ofand its relationship with mating behavior and the regulation of cotton volatiles, it is speculated that this gene is not only involved in the synthesis and release of female pheromone in, it may also play an important role in regulating male pheromones and regulating growth and development.

pink bollworm ();pheromone biosynthesis activating neuropeptide (PBAN); expression analysis; mating behavior; cotton volatiles

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.23.005

2018-08-06；

2018-09-19

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0201907）、國(guó)家棉花產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-15-18）

許冬，E-mail：ztb799@163.com。

萬鵬，E-mail：wanpenghb@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）