林明，鄧超宏，潘竟海，陳友強，劉華君，白曉山，肖麗，李承業(yè)

(新疆農業(yè)科學院經濟作物研究所，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】籽用西瓜(Citrulluslanatusvar.megulasnemusL.)，別名籽瓜，俗稱打瓜。籽用西瓜的主要利用部位是種子，其種子含有豐富的蛋白質成分和植物油。籽瓜瓤具備低脂、低糖、低熱量的特性，食用籽瓜瓤可起到利尿、潤肺、益肝、健脾等功效[1]。籽瓜適合在干旱、少雨、冷涼等環(huán)境下生長，新疆是中國籽瓜的最大產區(qū)，符合籽瓜生長的地區(qū)有昌吉、伊犁、巴音郭楞蒙古自治州、烏魯木齊、阿勒泰等地區(qū)，根據籽瓜的籽粒大小和顏色，將籽瓜分類為大片、小片和黑籽瓜、紅籽瓜[2]。在籽用西瓜種植生產中，由于品種混亂、品質參差不齊，常導致病害頻發(fā)，產量低而不穩(wěn)等情況發(fā)生。籽用西瓜的發(fā)源地并不是中國，自身資源也非常稀少，育種材料的親緣關系較單一，致使籽用西瓜在育種方面進展緩慢[3]。研究籽瓜育種材料之間的親緣關系非常必要，通過研究適宜的親緣關系和遺傳育種方式，將來自不同生態(tài)環(huán)境的個體在相同條件下種植，結合形態(tài)學分析與ISSR分子標記技術對籽瓜材料進行分類和遺傳多樣性的研究，研究籽用西瓜種間與種內的遺傳關系，對擴展籽瓜育種材料和培育新品種具有實際意義?！厩叭搜芯窟M展】分子標記是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映[4]，常用的分子標記有RAPD、AFLP、ISSR等，與形態(tài)標記相比，DNA分子標記具有一定的優(yōu)越性。為了促進西瓜的遺傳育種工作，分子標記技術在西瓜育種上的應用上已有大量的研究報到，但在籽用西瓜上卻罕見報到[5-9]?！颈狙芯壳腥朦c】應用分子標記研究籽瓜種質資源，利用不同類型種質資源的多態(tài)性，達到籽用西瓜種質資源的創(chuàng)新是當今籽用西瓜分子育種工作的發(fā)展方向[10-11]。ISSR(Inter-simple sequence re-peat，簡單重復序列間擴增)是基于PCR標記系統的一種新型的顯性分子標記技術。其標記為共顯性，對隱性的農藝性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析；分子標記揭示來自DNA的變異；檢測手段簡單、迅速。ISSR標記技術如今已經廣泛應用于西瓜種質資源的遺傳多樣性分析、品種的親緣關系鑒定，以及分子遺傳圖譜的構建等方面的研究[12-17]?！緮M解決的關鍵問題】以60份籽用西瓜種質資源為材料，利用ISSR分子標記技術分析籽用西瓜種質資源進行遺傳多樣性，為籽用西瓜分子育種打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

籽用西瓜種質資源于2015年5月種植于新疆奇臺縣西地鎮(zhèn)試驗田，選取其中表型較好、產量優(yōu)異的60份材料進行遺傳多樣性分析。表1

表1 60份籽用西瓜品種(系)名稱及形態(tài)特性
Table 1 Source and biological characteristics of 60 Seed-Watermelon Cultivars

序號No.品種名稱Name of lines來源Sources籽色Color大小Size序號No.品種名稱Name of lines來源Sources籽色Color大小Size1SWBB-01新疆黑大3140023新疆紅大2黑皮大板3甘肅黑大3240024甘肅紅中3黑中片新疆黑中3340026寧夏紅大4林籽1號甘肅黑大3440026-1廣西紅中5內蒙黑中片內蒙古黑大3540026-2廣西黑大6普通黑小片新疆黑小3640027江西紅中7新籽瓜1號新疆黑大3740027-1江西紅大8新籽瓜8號新疆黑大3840028廣西紅中9紅秀1號甘肅紅小3940028-1廣西紅中10紅秀2號甘肅紅大4040029廣西紅大11普通紅大片甘肅紅大4140029-1廣西紅中12新籽瓜4號新疆紅小4240029-2廣西棕中13紫荊紅新疆紅小4340030江西紅中1440002甘肅紅小4440032內蒙古黑大1540004甘肅褐小4540035內蒙古紅中1640008甘肅紅中4640035-1內蒙古紅小1740009甘肅紅中4740036內蒙古紅小1840009-1甘肅紅小4840037內蒙古紅小1940011甘肅棕小4940037-1內蒙古紅中2040012甘肅紅小5040043寧夏黑小2140013甘肅黑中5140043-1寧夏黑中2240013-1甘肅棕小5240045寧夏紅小2340013-2新疆紅小5340045-1寧夏紅中2440013-3新疆黑小5440047新疆黑大2540014新疆黑中5540049新疆黑大2640014-1新疆黑小5640060新疆棕大2740015新疆褐小5740060-1新疆黑大2840018新疆紅小5840063新疆棕大2940020新疆紅大5940065新疆棕中3040022新疆紅中6040067新疆黑大

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取和純化

取籽用西瓜幼苗葉片約0.20 g，經液氮冷凍，研缽內研磨成粉末。用DNA提取試劑盒提取葉片中的基因組DNA(北京天根)。利用核酸蛋白檢測儀(BioPhotometerplus，Eppendorf)測定DNA濃度，將DNA樣品稀釋到備用濃度，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ISSR-PCR反應體系的建立

對反應體系中的模版DNA、dNTPs、引物、Mg2+、Taq酶5因素采取4水平的正交試驗。正交試驗所用引物為UBC862，ISSR-PCR反應體系總體積為15 μL，其中10×Buffer2.5 μL，Mg2+2.5 μL，Taq酶0.3 μL，引物1 μL，dNTP 1 μL，DNA 1 μL，加ddH2O補齊至總體積為15 μL。表2，表3

表2 籽瓜ISSR-PCR反應體系正交試驗設計因素與水平
Table 2 Factors and levels of ISSR-PCR system of seed-used watermelon in orthogonal design

水平LevelMg2+(mmol/L)Taq-polymerase(U)Primer(μmol/L)dNTPs(mmol/L)DNA(ng)11.41.00.10.1254021.61.20.20.1505031.81.40.30.1756042.01.60.40.20070

表3 籽瓜ISSR反應條件正交組合設計
Table 3 Orthogonal design for ISSR-PCR optimization of seed-used watermelon

水平LevelMg2+(mmol/L)Taq-polymerase(U)Primer(μmol/L)dNTPs(mmol/L)DNA(ng)11.41.0 0.10.1254021.41.2 0.20.1505031.41.4 0.30.1756041.41.6 0.40.2007051.61.2 0.30.1257061.61.0 0.40.1506071.61.6 0.10.1755081.61.4 0.20.2004091.81.4 0.40.12550101.81.6 0.20.15040111.81.0 0.30.17570121.81.2 0.10.20060132.0 1.6 0.30.12560142.0 1.4 0.10.15070152.0 1.2 0.40.17540162.0 1.0 0.20.20050

1.2.3 多態(tài)性ISSR引物篩選

ISSR引物參照加拿大哥倫比亞大學(UBC)提供的序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。根據已建立的ISSR-PCR反應體系，以編號1材料的基因組DNA為模板，對100條ISSR引物進行多態(tài)性篩選，從中選取擴增條帶清晰，條帶數較多，重復性較好的引物進行PCR擴增。表4

表4 10對ISSR引物的編號及序列
Table 4 Serial numbers and sequences of 10 ISSR primers

引物編號Primer number引物序列Primer sequence(5′-3′)引物編號Primer number引物序列Primer sequence(5′-3′)UBC 808AGAGAGAGAGAGAGAGCUBC 861ACCACCACCACCACCACCUBC 814CTCTCTCTCTCTCTCTAUBC 862AGCAGCAGCAGCAGCAGCUBC 815CTCTCTCTCTCTCTCTGUBC 867GGCGGCGGCGGCGGCGGCUBC 824TCTCTCTCTCTCTCTCGUBC 886VDVCTCTCTCTCTCTCTUBC 826ACACACACACACACACCUBC 899CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA

1.2.4 ISSR標記擴增及電泳檢測

PCR擴增反應在Bio-RadPTC200PCR儀(Bio-Rad公司)上進行，擴增程序為94℃預變性5 min，94℃變性1 min，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min；4℃保存。PCR產物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，凝膠成像儀拍照并保存。

1.2.5 籽用西瓜遺傳多樣性

用篩選出的引物對60份籽用西瓜材料進行ISSR-PCR擴增和遺傳多樣性分析。將每條ISSR引物的擴增條帶進行編號閱讀，編號順序按照擴增條帶的分子量從大到小排列。在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，以數字數據記錄圖形數據，存于Excel表格。把Excel表格中的0、1序列數據陣導入NTSYS-PC 2.10e軟件中，進行運算處理，獲得參試品種遺傳相似系數的變異范圍，以及從Excel中得出ISSR引物的多態(tài)性信息量(PIC)的變化范圍，從而構建出供試60份籽用西瓜種質資源的聚類圖進行遺傳多樣性分析。

2 結果與分析

2.1 正交試驗

對16個反應體系進行測試和比較，結果顯示，反應體系16的擴增效果最好，將其確定為籽用西瓜的最佳ISSR-PCR反應體系，具體參數為：PCR擴增總體積15 μL，其中10×Buffer1.5 μL，Mg2+(2.0 mmol/L)2.5 μL，Taq酶(1 U/μL)0.3 μL，引物(0.2 μmol/L)1 μL，dNTP(0.2 mmol/L)1 μL，DNA(50 ng)1 μL，ddH2O 7.7 μL。圖1

2.2 ISSR標記的多態(tài)性

利用最佳的籽用西瓜ISSR-PCR反應體系，從引物中篩選出10個條帶清晰、多態(tài)性高、重復性好的引物(UBC808、814、815、824、826、861、862、867、886、899)，對60份籽用西瓜材料進行PCR擴增。共擴增出44條條帶，其中多態(tài)性條帶24條，多態(tài)性比率54.55%，每對引物等位變異數3～7個，10對引物平均多態(tài)性等位變異數4.4。10對ISSR引物的多態(tài)性信息量(PIC)的變化范圍為0.042 3～0.674 0，平均值為0.358 2。表5

圖1 籽用西瓜ISSR-PCR反應體系正交試驗設計擴增結果(引物為UBC862)
Fig.1 Amplification results of primer UBC862 in ISSR-PCR orthogonal experimental design of seed-used watermelon

表5 ISSR擴增多態(tài)性位點
Table 5 Polymorphic loci analysis of ISSR amplification

位點Loci退火溫度Annealing temperature(℃)等位位點數No.of alleles多態(tài)性位點數No.of polymorphic alleles多態(tài)性比率Ratio of polymorphic alleles(%)UBC-808514375.00%UBC-814544250.00%UBC-815563133.33%UBC-824524250.00%UBC-826506466.67%UBC-861543133.33%UBC-862524375.00%UBC-867534250.00%UBC-886557342.86%UBC-899515360.00%總計Total—4424—平均Average—4.42.4—

2.3 參試品種(系)遺傳多樣性

利用NTSYS-PC 2.10e遺傳分析軟件，根據ISSR標記數據計算出品種間的遺傳相似系數(GS)。60份參試品種遺傳相似系數的變異范圍為0.318～0.992，平均值為0.779。材料13(紫荊紅)與材料47(40036)間的遺傳相似性最低，為0.318。材料31(40011)與材料32(40013)、49與51、22與28、19與26、36，38、59間的遺傳相似性最高，為0.992。

根據各籽用西瓜品種的遺傳相似系數矩陣，利用UPGMA法進行聚類分析。以聚類結果繪制DNA指紋圖譜。以遺傳相似系數0.70為界限，將60份籽用西瓜材料劃分為6個組群。第一組為材料47(40036)，第二組為材料8(新籽瓜8號)，第三組為材料10(紅秀2號)、11(普通紅大片)、12(新籽瓜4號)、13(紫荊紅)、14(40002)、15(40004)、16(40008)，第四組為材料7(新籽瓜1號)，第五組為材料52(40045)，其余的都歸類為第六組。圖2

圖2 基于ISSR標記的60份籽用西瓜種質聚類圖
Fig.2 Dendrogram of cluster analysis based on ISSR of 60 Seed-watermelon

3 討 論

柳唐鏡等[18]利用RAPD分子標記對野生型籽用西瓜和栽培紅籽瓜進行遺傳多樣性分析，結果顯示，野生型與栽培型紅籽瓜種質間遺傳距離較遠，野生種類型之間的遺傳距離也相對較遠，而栽培籽瓜種質間親緣關系很近。ISSR分子標記技術在西瓜上的應用廣泛，劉海洋[19]通過正交設計建立了西瓜ISSR反應體系；黃歆賢等[20]在西瓜種子真實性和純度鑒別中發(fā)現，利用2條ISSR引物將18個西瓜品種互相鑒別，ISSR分子標記是西瓜品種鑒定的有效指紋分析工具，在雜交種種子質量檢測過程中也同樣有效。植物品種資源的遺傳多樣性研究是優(yōu)異品種選育的基礎，通過表型的系統分析和分子標記可有效區(qū)分和挖掘特異優(yōu)異資源并進行品種改良，如番茄[21]、辣椒[22]。研究中，60個材料按相似性系數共聚為6個類群，多數籽粒顏色相同的品種材料其親緣關系表現較勁，在1～5組的分類都是按顏色區(qū)分；在第3組中，品種材料的籽粒顏色都為紅色；根據來源區(qū)分，雖然新籽瓜4號和紫荊紅來源于新疆，其余的材料都來自于甘肅，但是這兩個材料的親本都來自于甘肅的資源材料，來源相同、籽粒顏色相同的品種材料間親緣關系也較近。在第6組中的品種材料，群體大且各個地方的都有，因為種質資源的流通量比較大，在選育過程中選擇了相同的親本導致的。

4 結 論

對60份籽用西瓜品種進行擴增，共擴增出44個為多態(tài)性位點，多態(tài)性比率為54.55%；核心引物的PIC值變幅為0.042 3～0.674 0，平均值為0.358 2，表明ISSR標記在60份籽用西瓜品種間均可以反映較豐富的遺傳多樣性信息。ISSR分子標記相對于其他分子標記具有更好的穩(wěn)定性和多態(tài)性，對于基因多態(tài)性的發(fā)現非常有用，因而是非常實用的分子標記。ISSR對籽用西瓜種質資源的遺傳多樣性和親緣關系的確定相比其他分子標記更有優(yōu)勢，更為全面的基因組DNA信息，為雜交育種親本間的組配上提供了可靠的分子水平信息，ISSR分子標記是籽用西瓜種質資源研究遺傳基礎差異性和親緣關系高效、快捷的新技術。