賈定洪，李小林，周 潔，彭衛(wèi)紅，譚 偉，黃忠乾，甘炳成

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，四川成都 610066)

【研究意義】纖維素分解為葡萄糖至少需要3種纖維素酶，包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶。而福壽螺(Ampullaria crossean)胃組織分離的纖維素酶基因(multi-functional cellulase gene，Mfc)能夠編碼內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶這三種纖維素酶［1］，是一種多功能纖維素酶，應(yīng)用前景看好。而毛木耳是一種木腐真菌，其纖維素降解等能力是生物轉(zhuǎn)化率的酶學(xué)基礎(chǔ)，是毛木耳實現(xiàn)高產(chǎn)的重要保證。但是獨立的酶基因無法啟動其自身表達(dá)，只有適合于宿主的啟動子、基因及終止子的適當(dāng)組合，才能夠啟動目標(biāo)基因表達(dá)，考察其對宿主性狀的作用。因此，通過宿主啟動子的克隆、目標(biāo)基因密碼子優(yōu)化及終止子的正確組裝，將是實現(xiàn)多功能纖維素酶基因Mfc在毛木耳細(xì)胞中表達(dá)和改良菌株纖維素降解能力的必要前提?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前多功能纖維素酶基因Mfc已在灰蓋鬼傘［2］和草菇［3］等食用菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)化研究。但Mfc基因來源于福壽螺組織，在毛木耳細(xì)胞中不一定能夠穩(wěn)定高效表達(dá)。為了將該基因改造成為具有毛木耳物種偏好性［4］的編碼序列，以免影響基因的蛋白翻譯［5］，前期實驗中賈定洪已將多功能纖維素酶基因Mfc改造為具備毛木耳密碼子偏好性的基因Mfcsg［6］，為該基因在毛木耳細(xì)胞中表達(dá)奠定了基礎(chǔ)?！颈狙芯壳腥朦c】實驗通過毛木耳Gpd啟動子、內(nèi)含子intron及改造型Mfcsg基因克隆，將之與pPK2質(zhì)粒EcoRI酶切大片段進(jìn)行無縫克隆，分別構(gòu)建農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體pAKMFC、pAKIMFC，為多功能纖維素酶基因Mfc在毛木耳細(xì)胞中轉(zhuǎn)化表達(dá)和種性改良奠定基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】組裝形成Mfcsg基因表達(dá)盒，構(gòu)建該基因啟動子、目的基因及終止子轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，為多功能纖維素酶基因Mfcsg在毛木耳細(xì)胞轉(zhuǎn)化表達(dá)提供具有自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。

1 材料與方法

1.1 材料與質(zhì)粒

pPK2質(zhì)粒購自杭州工道生物技術(shù)有限公司。DH5(感受態(tài)細(xì)胞購自上海超研生物科技有限公司。ClonExpress MultiS多片段無縫克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，其它試劑購自生工生物工程上海(股份)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉(zhuǎn)化載體pAKMFC構(gòu)建 EcoRⅠ酶切質(zhì)粒pPK2，回收大片段，應(yīng)用引物對1Fakmfc/1Rakmfc、Mfcfakmfc/Mfcrakmfc、CFakmfc/CRakmfc 分別擴(kuò)增毛木耳Gpd啟動子、Mfcsg基因、Hpt部分基因(引物見表1)，按照ClonExpress MultiS多片段無縫克隆試劑盒方法一步克隆獲得農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體pAKMFC［7］。

1.2.2 轉(zhuǎn)化載體 pAKIMFC構(gòu)建 EcoRⅠ酶切pPK2質(zhì)粒，回收大片段，應(yīng)用引物對 1Fakimfc/1Rakimfc、AFakimfc/ARakimfc、Mfcfakimfc/Mfcrakimfc、CFakimfc/CRakimfc分別擴(kuò)增毛木耳 Gpd啟動子、intron、Mfcsg基因、Hpt部分基因(引物見表 2)，按照1.2.1方法構(gòu)建農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化載體pAKIMFC。

1.2.3 轉(zhuǎn)化載體pAKMFC、pAKIMFC測序驗證pAKMFC、pAKIMFC質(zhì)粒構(gòu)建后熱激轉(zhuǎn)化到 DH5(感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆送生工生物工程上海(股份)有限公司測序，測序引物為 pPK2f(5’-CTAGCCAATACGCAAACCGC-3’)和 pPK2r(5’-CTTAGTAGGAATGATTTTCG-3’)，該引物可以擴(kuò)增pAKMFC、pAKIMFC改造區(qū)DNA序列。

表1 pAKMFC載體構(gòu)建引物序列表Table 1 Primer sets used for the plasmid construction of pAKMFC

表2 pAKIMFC載體構(gòu)建引物序列表Table 2 Primer sets used for the plasmid construction of pAKIMFC

圖1 pAKMFC質(zhì)粒測序驗證圖Fig.1 pAKMFC plasmid validated by sequencing

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)化載體pAKMFC測序驗證

將質(zhì)粒pAKMFC測序獲得的序列與目標(biāo)序列比對，發(fā)現(xiàn)改造獲得的質(zhì)粒與目標(biāo)設(shè)計序列完全一致，改造后的質(zhì)粒中Gpd啟動子、Mfcsg基因、Hpt基因構(gòu)件完整、準(zhǔn)確，達(dá)到了實驗預(yù)期(圖1)。將測序序列與pPK2質(zhì)粒大片段拼接后獲得pAKMFC質(zhì)粒圖譜(圖2)

2.2 轉(zhuǎn)化載體pAKIMFC測序驗證

將質(zhì)粒pAKIMFC測序獲得的序列與目標(biāo)序列比對，發(fā)現(xiàn)改造獲得的質(zhì)粒與目標(biāo)設(shè)計序列完全一致，改造后的質(zhì)粒中Gpd啟動子、intron、Mfcsg基因、Hpt基因構(gòu)件完整、準(zhǔn)確，達(dá)到了實驗預(yù)期(圖3)。將測序序列與pPK2質(zhì)粒大片段拼接后獲得pAKMFC質(zhì)粒圖譜(圖4)。

3 討論

圖2 pAKMFC質(zhì)粒圖譜Fig.2 Plasmid profile of pAKMFC

圖4 pAKIMFC質(zhì)粒圖譜Fig.4 Plasmid profile of pAKIMFC

表達(dá)元件的正確組裝是目的基因有效表達(dá)的前提。采用合適的啟動子、適合于宿主密碼子偏好性的基因序列及有效終止子，將促進(jìn)目標(biāo)基因高效表達(dá)。本實驗采用毛木耳Gpd啟動子、具備毛木耳密碼子偏好性的多功能纖維素酶基因、潮霉素B抗性基因及構(gòu)巢曲霉終止子，構(gòu)建了較為理想的適合于毛木耳表達(dá)的多功能纖維素酶表達(dá)盒。實驗共設(shè)計構(gòu)建了2個農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pAKMFC和pAKIMFC，它們之間區(qū)別在于pAKIMFC是在pAKMFC的啟動子與表達(dá)基因之間插入了一段pPK2質(zhì)粒原有的內(nèi)含子GpdA，目的在于考察內(nèi)含子對于基因表達(dá)的影響。實驗構(gòu)建形成了適合于農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化毛木耳應(yīng)用的改造型多功能纖維素酶基因Mfcsg雙元表達(dá)質(zhì)粒pAKMFC和pAKIMFC，并且已成功用農(nóng)桿菌AGL1::pAKMFC和AGL1::pAKIMFC轉(zhuǎn)化毛木耳，提高了毛木耳菌絲的吃料能力(結(jié)果另文發(fā)表)，該研究為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的多功能纖維素酶Mfcsg基因轉(zhuǎn)化改良毛木耳奠定了基礎(chǔ)。