李景壯，曾 娟，聶天瑩，肖 飛，段亞玲

（貴州省分析測試研究院，貴陽 550002）

隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)要求的提高，微生物農(nóng)藥成為今后農(nóng)藥的發(fā)展方向之一。蘇云金桿菌是包括許多變種的一類產(chǎn)晶體芽孢桿菌，具有專一性、高效和對(duì)人畜安全等優(yōu)點(diǎn)。目前蘇云金桿菌商品制劑已達(dá)100多種，是世界上應(yīng)用范圍最廣、用量最大、研究最多的微生物殺蟲劑。

由于蘇云金桿菌商品制劑種類繁多、應(yīng)用廣泛，因此，對(duì)市場上蘇云金桿菌商品制劑產(chǎn)品進(jìn)行分類鑒別尤為重要。本文建立了蘇云金桿菌商品制劑菌株快速分離純化的前處理方法和鑒定方法，為保證我國微生物農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量，推動(dòng)微生物農(nóng)藥的快速發(fā)展提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 分離材料

以市場上購買的蘇云金桿菌商品制劑（懸浮劑）為試驗(yàn)材料，4℃保存以確保制劑中微生物的生物活性。

1.2 培養(yǎng)基

形態(tài)特征及生理生化特征試驗(yàn)所用培養(yǎng)基采用細(xì)菌培養(yǎng)[1]。

1.3 主要試劑

75%乙醇水溶液、0.1%氯化汞甲醇溶液、牛肉膏、瓊脂條、蛋白胨、NaCl，均為分析純；Tris-HCl緩沖液、核酸染料GoldView、瓊脂糖，北京鼎國生物技術(shù)有限公司；EX Taq酶、脫氧核糖核苷三磷酸dNTP、10×EX Taq緩沖液，寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；引物10p primr1、引物10p primr2、DL 2000 DNA Marker、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，北京新時(shí)代生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.4 主要試驗(yàn)儀器

PCR儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；凝膠成像儀、電泳系統(tǒng)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；恒溫水浴鍋、PRX-250B人工氣候培養(yǎng)箱，上海比郎儀器有限公司；醫(yī)用離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；AL204電子天平，梅特勒-托利多公司；S-3400N掃描電鏡，日本HITACHI公司；WP700TL23-K5格蘭仕微波爐。

1.5 方法

1.5.1 分離、純化與保存

制劑商品表面消毒方法按《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》操作[2]。用無菌滴管吸取0.5 mL蘇云金桿菌懸浮劑，放入盛有100 mL無菌水的燒杯中，制得10-1稀釋液，然后按10倍的梯度稀釋到10-6。取不同稀釋倍數(shù)的菌懸液0.5 mL滴入平板培養(yǎng)基中，于28～30℃培養(yǎng)箱中混菌培養(yǎng)3～4 d。根據(jù)菌落的不同形態(tài)，在牛肉膏蛋白胨平板上進(jìn)一步劃線純化、培養(yǎng)，然后將純化后所得菌落轉(zhuǎn)入裝有牛肉膏蛋白胨的試管中，進(jìn)行編號(hào)，4℃保存?zhèn)溆肹3]。

1.5.2 蘇云金桿菌的形態(tài)特征

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第8版）、《微生物分類學(xué)》（1999版）、《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（2001版）的方法，對(duì)蘇云金桿菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)及生理生化特征鑒定。

1.5.3 菌株基因組DNA的提取及PCR反應(yīng)條件

細(xì)菌菌株基因組DNA的提?。翰捎帽本┬聲r(shí)代生物技術(shù)有限責(zé)任公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取。

擴(kuò)增引物：采用擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F/1492R[4]，由北京新時(shí)代生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，引物具體信息見表1。PCR反應(yīng)體系總體積為50 mL，其中包括5.0 mL 10×EX Taq緩沖液、4.0 mL dNTP Mix（2.5 mM）、2.0 mL引物10p primr 1、2.0 mL引物10p primr 2、0.5 mL EX Taq酶（5u 2.0 mL模板Template）、36.5 mL無菌超純水。

表1 引物序列

1.5.4 PCR產(chǎn)物電泳檢測

稱取0.24 g瓊脂糖加入至30 mL 0.5×TBE緩沖液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%瓊脂糖凝膠檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。每孔點(diǎn)5 mL樣品（3 mL PCR產(chǎn)物＋2 mL loading緩沖液），預(yù)留1個(gè)孔加入3 mLDL2000 DNAMarker，在80 V恒壓下電泳50 min，電泳結(jié)束后將其放在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并照相。

1.5.5 切膠純化、測序

將PCR產(chǎn)物純化后送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。獲得的序列去除載體序列后，進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，確定菌株的類別。

1.5.6 DNA序列分析及發(fā)育樹的構(gòu)建

將測序獲得的16S rDNA序列先提交到NCBI中，在GenBank中獲得注冊(cè)號(hào)，然后通過BLAST進(jìn)行序列比對(duì)。根據(jù)同源性相似度差異，選取同源性較高的模式菌株，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)分離菌株與數(shù)據(jù)庫中登錄的近源菌株系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離及生理生化特性鑒定

采用稀釋法，根據(jù)菌落在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上的形態(tài)特征，經(jīng)過多次劃線分離純化，得到純化菌株，編號(hào)為D。

在顯微鏡下觀察菌株D，其營養(yǎng)體細(xì)胞為桿狀，較為粗壯，單生或雙聯(lián)體，并以雙聯(lián)體為單位連成短桿狀。菌體運(yùn)動(dòng)活躍，形成芽孢和伴孢晶體。芽孢呈橢圓形，孢囊不膨大。伴孢晶體呈菱形、近圓形、方形、三角形或不規(guī)則形狀，晶體大小不均。該菌落在牛肉膏蛋白胨、葡萄糖瓊脂平板上擴(kuò)展較快。菌株D電鏡掃描圖像如圖1所示。

圖1 菌株D的電鏡掃描照片

菌株D的菌落外觀為圓形，呈淡黃色透明狀，表面濕潤黏稠，邊緣不規(guī)則，略有隆起。菌株D的菌體呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性，有芽孢、鞭毛。菌株D的生理生化測定結(jié)果見表2。

表2 菌株D的生理生化特征

2.2 基于16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析和分子鑒定

通過BLAST比對(duì)后，與NCBI數(shù)據(jù)庫中已收錄的同源性較高的菌株進(jìn)行核苷酸同源性比較。菌株D構(gòu)建發(fā)育樹所用各個(gè)物種16S rDNA的GenBank序列注冊(cè)號(hào)見表3，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹見圖2。

表3 菌株D構(gòu)建發(fā)育樹所用16S rDNA序列的注冊(cè)號(hào)

從表3中可以看出：菌株D與Bacillus thuringiensis、Bacillus cereus、Bacillus sp.、Bacillus wiedmannii、Bacillus aryabhattai、Bacillus proteolyticus、Bacillus subtilis的相似性均為100%。從圖2發(fā)育樹中可以看出：菌株D的16S rDNA序列與芽胞桿菌屬Bacillus中的Bacilluscereus strain（GenBank登錄號(hào)為CP026678）在同一個(gè)分支上，親緣關(guān)系最近，序列相似性為100%。

圖2 基于16S rDNA序列菌株D的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

本文建立了蘇云金桿菌懸浮劑樣品的前處理及菌種鑒定方法。該方法能夠快速、簡便、準(zhǔn)確地對(duì)蘇云金桿菌商品制劑的菌種進(jìn)行鑒別，滿足試驗(yàn)要求。根據(jù)菌株形態(tài)、生理生化特征及16S rDNA分析結(jié)果，該蘇云金桿菌懸浮劑中菌株D為蠟質(zhì)芽孢桿菌菌株（Bacillus cereus strain），而非蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis strain）。