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(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642)

高良姜(AlpiniaofficinarumHance),別名良姜、小良姜,是雙子葉藥姜科植物,主產(chǎn)于廣東、廣西、云南、海南、臺(tái)灣等地,是一種熱帶多年生的山姜,屬食藥兼用的植物資源[1],具有溫胃止吐、散寒止痛、抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗腹瀉等功效,可用于食品的調(diào)味劑、著色劑及抗氧化劑,醫(yī)藥方面還可用于治療消化不良、反酸嘔吐、胃潰瘍等消化道系統(tǒng)疾病[2-4],具有較高商業(yè)價(jià)值。

高良姜中有效成分主要為揮發(fā)油、黃酮類(lèi)及二芳基庚烷類(lèi)化合物。目前對(duì)高良姜的開(kāi)發(fā)利用主要集中在提取揮發(fā)油,其可作為鎮(zhèn)痛止嘔藥使用,也可應(yīng)用于食品、日化、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。然而高良姜中揮發(fā)油含量一般只有1%左右,提取揮發(fā)油后的殘?jiān)嫉?9%,且目前基本上沒(méi)有加以利用,造成極大的資源浪費(fèi)。高良姜?dú)堅(jiān)泻胸S富的黃酮類(lèi)物質(zhì),具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、鎮(zhèn)痛等作用[5-10]。國(guó)內(nèi)已有通過(guò)大孔樹(shù)脂和薄層層析法分離純化高良姜總黃酮的研究,結(jié)果表明,經(jīng)純化后黃酮純度能得到有效提升[11-12]。但相關(guān)研究仍相對(duì)匱乏,且未見(jiàn)對(duì)純化前后的高良姜黃酮進(jìn)行功能性測(cè)定的研究。

本研究以提取揮發(fā)油后的高良姜?dú)堅(jiān)鼮樵?提取其中的黃酮,并利用大孔樹(shù)脂進(jìn)行分離純化,探討其分離純化條件,以期獲得純度較高、抗氧化活性較強(qiáng)的黃酮類(lèi)化合物,為高良姜資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高良姜 采自廣東湛江徐聞縣,經(jīng)自然干燥成樣品;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) 上海如吉生物科技有限公司;DPPH·標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%) 美國(guó)Sigma公司;大孔樹(shù)脂AB-8、XAD-2、HPD-600、S-8、D-101 鄭州華溢新技術(shù)有限公司;大孔樹(shù)脂XDA-6、LSA-12、LX-213 西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司;硫酸鈉、無(wú)水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、濃鹽酸、鄰苯三酚 分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠(chǎng);三羥甲基氨基甲烷 分析純,美國(guó)Sigma公司。

HWS24恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;LRH-150B恒溫培養(yǎng)箱 廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司;UV-5200紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;HY-5回旋式振蕩器 常州澳華儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器有限公司;DW-HL828超低溫冰箱 安徽中科美菱低溫科技股份有限公司;Lab-1C-50真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高良姜黃酮的提取 以高良姜為原料,粉碎并過(guò)20目篩,參考《中國(guó)藥典》2015版第四部揮發(fā)油測(cè)定甲法并作適當(dāng)修改[13],在料液比1∶12 g/mL、浸泡時(shí)間30 min的條件下提取揮發(fā)油,提取45 min后制得殘?jiān)?。取一定量高良姜?dú)堅(jiān)?按料液比1∶40 g/mL加入57%(v/v)的乙醇,在82 ℃水浴下浸提3 h,將所得提取液經(jīng)離心(5000 r/min,20 min)分離,取上清液于55 ℃、0.025 MPa下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無(wú)醇味浸膏,用水稀釋至適當(dāng)濃度即為黃酮粗提液。

1.2.2 黃酮的測(cè)定 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[14],以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),得到黃酮濃度與吸光度之間的回歸方程:y=5.7611x+0.0561(R2=0.9995),按該方程計(jì)算黃酮含量。

1.2.3 樹(shù)脂預(yù)處理 參考吳彩霞等[15]方法對(duì)大孔樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理。

1.2.4 靜態(tài)吸附與解吸

1.2.4.1 樹(shù)脂的篩選 分別稱(chēng)取預(yù)處理后的大孔樹(shù)脂HPD-600、S-8、XDA-6、LSA-12、LX-213、AB-8、D-101各1.000 g于錐形瓶中,加入50 mL濃度為1.5 mg/mL的黃酮粗提液并置于搖床中,恒溫25 ℃振搖(180 r/min)24 h,測(cè)定上清液黃酮濃度;用濾網(wǎng)濾去粗提液后,用200 mL蒸餾水沖洗樹(shù)脂并移入錐形瓶中,加入50 mL無(wú)水乙醇,于恒溫25 ℃下振搖(180 r/min)解吸24 h,測(cè)定上清液中黃酮濃度。

參照以下公式計(jì)算吸附率(Q1)、解吸率(Q2)和黃酮得率(Q3)。

其中,C0、C1、C2分別為黃酮粗提液、吸附平衡后溶液和解吸平衡后解吸液的濃度(mg/mL);V1、V2分別為吸附后濾液和解吸液的體積(mL);m為大孔樹(shù)脂質(zhì)量(g)。

1.2.4.2 吸附與解吸動(dòng)力學(xué) 按1.2.4.1的條件,對(duì)所篩選出的3種樹(shù)脂進(jìn)行靜態(tài)吸附,每1 h測(cè)定一次上清液的黃酮濃度至吸附平衡,再用50 mL 70%的乙醇進(jìn)行靜態(tài)解吸,每10 min測(cè)定一次上清液的黃酮濃度至解吸平衡,計(jì)算樹(shù)脂的吸附量和解吸量,繪制吸附和解吸動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。

1.2.4.3 洗脫液的篩選 取吸附飽和的XDA-6大孔樹(shù)脂1 g于5個(gè)錐形瓶中,加入50 mL濃度分別為60%、70%、80%、90%、100%(v/v)乙醇,按1.2.4.1的條件進(jìn)行靜態(tài)解吸,取上清液測(cè)定解吸平衡時(shí)黃酮濃度,篩選最優(yōu)的洗脫液。

1.2.5 動(dòng)態(tài)吸附與解吸

1.2.5.1 上樣流速對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響 采用濕法裝柱將預(yù)處理好的XDA-6大孔樹(shù)脂裝入層析柱中,將濃度為2 mg/mL的黃酮粗提液分別按1、2、3 BV/h的流速上樣,每10 mL收集一管,測(cè)定其黃酮濃度,繪制動(dòng)態(tài)滲透曲線(xiàn)。

1.2.5.2 上樣液濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響 采用濕法裝柱將預(yù)處理好的XDA-6大孔樹(shù)脂裝入層析柱中,將濃度分別為1、2、3 mg/mL的粗提液按2 BV/h的流速上樣,每10 mL收集一管,測(cè)定其黃酮濃度,繪制動(dòng)態(tài)滲透曲線(xiàn)。

1.2.5.3 洗脫液流速對(duì)動(dòng)態(tài)解吸的影響 將粗提液按最優(yōu)條件上樣,以蒸餾水充分洗去雜質(zhì),用70%乙醇分別按0.5、1.5、2.5 mL/min的流速進(jìn)行動(dòng)態(tài)洗脫,每2 mL流出液收集一管,測(cè)定流出液的黃酮濃度,繪制洗脫曲線(xiàn)。

1.2.6 純化效果評(píng)價(jià)

1.2.6.1 純度的測(cè)定 將純化前后的黃酮溶液于55 ℃、0.025 MPa下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無(wú)醇味,然后置于-80 ℃中預(yù)冷24 h,在真空度為0.1 kPa,冷凍溫度為-55 ℃,冷凍時(shí)間為24 h的條件下真空冷凍干燥成干粉樣品,取等質(zhì)量?jī)龈蓸悠酚谜麴s水溶解并測(cè)定黃酮含量,按下式計(jì)算純度:

式中,c為凍干樣品溶液的黃酮濃度(mg/mL);v為定容體積(mL);m0為凍干樣品質(zhì)量(mg)。

1.2.6.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定 將純化前后的樣品溶液稀釋至等濃度,測(cè)定DPPH自由基清除能力[16],按以下公式計(jì)算清除率:

式中,A0為樣品溶劑與DPPH-乙醇溶液混合液的吸光值;A為樣品溶液與DPPH-乙醇溶液混合液的吸光值;B為樣品溶液與無(wú)水乙醇混合液的吸光值。

1.2.6.3 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法[17]測(cè)定純化前后樣品溶液的超氧陰離子自由基清除能力,按以下公式計(jì)算清除率:

式中,F0為T(mén)ris-HCl、樣品溶劑與鄰苯三酚-HCl溶液的吸光度增加速率;F為T(mén)ris-HCl、樣液與鄰苯三酚-HCl溶液的吸光度增加速率。

1.2.6.4 還原能力的測(cè)定 采用普魯士藍(lán)法[18]測(cè)定純化前后樣品溶液的還原能力,吸光值越高,還原能力越強(qiáng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理,Origin 9.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜態(tài)吸附與解吸

2.1.1 樹(shù)脂篩選 通過(guò)靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn),7種大孔樹(shù)脂的吸附率和解吸率測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 7種大孔樹(shù)脂的吸附和解吸性能Table 1 Capacities of absorption and desorption of 7 kinds of macroporous resins

由表1可知,吸附率大小排序?yàn)?XDA-6>LSA-12>AB-8>S-8>HPD-600>LX-213>D-101;解吸率從高到底的順序?yàn)?D-101>LX-213>AB-8>XDA-6>LSA-12>HPD-600>S-8;黃酮得率從高到底的順序?yàn)?AB-8>XDA-6>LX-213>LSA-12>D-101>HPD-600>S-8;綜合考慮吸附率、解吸率及黃酮得率,其中AB-8、XDA-6和LX-213的黃酮得率都在75%以上且較為接近,因此,選用這3種樹(shù)脂進(jìn)行下一步的篩選。

2.1.2 吸附與解吸動(dòng)力學(xué) 根據(jù)2.1.1結(jié)果篩選出的3種大孔樹(shù)脂吸附和解吸動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)分別如圖1和圖2所示。

圖1 3種大孔樹(shù)脂的吸附動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)Fig.1 Absorption kinetics curve of 3 kinds of macroporous resins

圖2 3種大孔樹(shù)脂的解吸動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)Fig.2 Desorption kinetics curve of 3 kinds of macroporous resins

從圖1可以看出,3種樹(shù)脂在前5 h的吸附量增加迅速,吸附速度較快,至8 h后基本達(dá)到平衡,此時(shí),3種樹(shù)脂的吸附量以XDA-6最大,其次是AB-8,LSA-12最小;從圖2的解吸效果來(lái)看,XDA-6和LSA-12的解吸速度相對(duì)較快,10 min即可達(dá)到解吸平衡,且相同時(shí)間下XDA-6的解吸量高于LSA-12,而AB-8解吸速度相對(duì)較慢,需20 min才達(dá)到解吸平衡。綜合考慮,XDA-6更適合于高良姜黃酮的分離純化。

2.1.3 洗脫液篩選 不同濃度乙醇溶液的解吸結(jié)果如圖3所示。

圖3 乙醇濃度對(duì)解吸率的影響Fig.3 Effect of concentration of ethanol on desorption rate

由于乙醇濃度不同其極性強(qiáng)弱也有所不同,從而對(duì)黃酮的解吸產(chǎn)生影響,從圖3可知,隨乙醇濃度的升高解吸率呈先上升后下降的趨勢(shì),以70%乙醇的解吸率最高,達(dá)97.9%,當(dāng)乙醇濃度大于70%時(shí)解吸率下降,說(shuō)明70%乙醇極性適中,適合于高良姜黃酮的洗脫。

2.2 動(dòng)態(tài)吸附與洗脫

2.2.1 上樣流速對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響 不同上樣流速的動(dòng)態(tài)滲透曲線(xiàn)如圖4所示。

圖4 上樣流速對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響Fig.4 Effects of sample flow rate on dynamic absorption

由圖4可以看出,泄漏濃度會(huì)隨上樣流速的增加而上升,流速為1、2、3 BV/h時(shí),達(dá)到泄漏點(diǎn)的流出液分別為31.6、31.6、21.0 BV,表明流速過(guò)快會(huì)使樹(shù)脂吸附能力變差,降低黃酮利用率。因此,上樣流速不宜過(guò)大,而較慢(1 BV/h)的流速使樹(shù)脂達(dá)泄漏點(diǎn)的時(shí)間較長(zhǎng),樹(shù)脂吸附效率較低,并且容易造成黃酮粗提取物在樹(shù)脂柱上層析出和沉積,影響柱床的穩(wěn)定從而影響純化效果。綜合考慮,選擇2 BV/h為最適上樣流速,此時(shí),泄漏點(diǎn)的流出液體積為31.6 BV。

2.2.2 上樣液濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響 不同上樣液濃度的動(dòng)態(tài)滲透曲線(xiàn),結(jié)果如圖5所示。

圖5 上樣液濃度對(duì)動(dòng)態(tài)吸附的影響Fig.5 Effects of flavonoid concentration of sample on dynamic absorption

由圖5可知,上樣濃度對(duì)黃酮的泄漏影響較大,上樣濃度較高,為3 mg/mL時(shí),黃酮泄漏較多,樹(shù)脂過(guò)早達(dá)到泄漏點(diǎn),且容易造成樣品的浪費(fèi)及柱床堵塞;而上樣濃度較低,為1 mg/mL時(shí),樹(shù)脂的吸附效率較低。因此,上樣液的濃度以2 mg/mL為宜,對(duì)應(yīng)的泄漏點(diǎn)體積為31.6 BV。

2.2.3 洗脫液流速及用量對(duì)動(dòng)態(tài)解吸的影響 不同洗脫液流速的洗脫曲線(xiàn)如圖6所示。

圖6 洗脫液流速對(duì)動(dòng)態(tài)解吸的影響Fig.6 Effects of elution flow rate on dynamic desorption

由圖6可以看出,1.5 mL/min和2.5 mL/min的流速洗脫效果較好,峰形對(duì)稱(chēng),峰較高,而以0.5 mL/min的流速洗脫時(shí),出峰較早,濃度峰不完整。綜合考慮生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)性,選擇洗脫流速為2.5 mL/min。當(dāng)洗脫液用量達(dá)到3.1 BV時(shí),流出液已基本不含黃酮,故洗脫液用量以3.1 BV為佳。

2.3 純化效果評(píng)價(jià)

2.3.1 純度測(cè)定 測(cè)定純化前后黃酮的純度發(fā)現(xiàn),黃酮經(jīng)分離純化后,純度由43.55%±0.15%提高到了85.42%±0.64%,純度提升為原來(lái)的1.9倍,純化效果理想,RSD值小于1.5%,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)精度高,效果顯著。

2.3.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定 純化前后的高良姜?dú)堅(jiān)S酮對(duì)DPPH自由基的清除效果如圖7所示。

圖7 DPPH自由基清除效果Fig.7 Results of DPPH free radicals scavenging

從圖7可知,高良姜?dú)堅(jiān)S酮對(duì)DPPH自由基清除能力隨濃度增加而增強(qiáng);相同濃度下,純化后的黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力較強(qiáng),清除率極顯著高于純化前的黃酮(p<0.05)。IC50由純化前的0.014 mg/mL降低到純化后的0.012 mg/mL。

2.3.3 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定 分別測(cè)定純化前后的高良姜?dú)堅(jiān)S酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果,結(jié)果如圖8所示。

圖8 超氧陰離子自由基清除效果Fig.8 Results of superoxide anion free radicals scavenging

從圖8可得,高良姜黃酮對(duì)超氧陰離子自由基清除能力隨濃度增加而增強(qiáng);在黃酮濃度為0.12～0.24 mg/mL的范圍內(nèi),等濃度下純化后黃酮對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力均比純化前強(qiáng),清除效果顯著優(yōu)于純化前(p<0.05),其純化前高良姜黃酮的IC50為0.222 mg/mL,經(jīng)純化后降低到了0.186 mg/mL。

2.3.4 還原能力的測(cè)定 純化前后的高良姜?dú)堅(jiān)S酮的還原能力結(jié)果如圖9所示。

圖9 還原能力測(cè)定Fig.9 Results of reducing ability test

從圖9可以看出,純化后黃酮的還原能力顯著優(yōu)于純化前(p<0.05);在低濃度時(shí),純化前和純化后的高良姜黃酮還原能力較為接近,但隨濃度增加至0.2 mg/mL時(shí),純化后黃酮的還原能力大于純化前的,且隨濃度的上升,純化后黃酮還原能力增長(zhǎng)速度要比純化前快,當(dāng)濃度達(dá)到0.65 mg/mL時(shí),純化后黃酮的還原能力為2.55大于純化前的1.97。可見(jiàn),高良姜黃酮經(jīng)純化后的抗氧化活性增加。

3 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定7種大孔樹(shù)脂對(duì)高良姜黃酮的靜態(tài)吸附和解吸能力,篩選出效果最優(yōu)的大孔樹(shù)脂為XDA-6,并進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附和解吸試驗(yàn),優(yōu)化出最佳分離純化條件為:上樣流速2 BV/h,上樣液濃度2 mg/mL,上樣量31.6BV,洗脫液為70%(v/v)乙醇,洗脫液流速2.5 mL/min,用量3.1BV,在此條件下,黃酮的純度由43.55%±0.15%提高到了85.42%±0.64%;純化后的黃酮具有更強(qiáng)的還原能力,對(duì)DPPH和超氧陰離子自由基清除率有所提高,IC50值分別由純化前的0.014、0.222 mg/mL降低到純化后的0.012、0.186 mg/mL,說(shuō)明純化有利于提高黃酮的抗氧化活性。