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(嶺南師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,廣東湛江 524048)

番木瓜(CaricapapayaL.),屬番木瓜科,番木瓜屬,又名木瓜、萬(wàn)壽果等。番木瓜屬藥食兼用水果,含有糖類(lèi)、木瓜蛋白酶、黃酮類(lèi)、類(lèi)胡蘿卜素、多酚類(lèi)、萜烯類(lèi)和生物堿等多種營(yíng)養(yǎng)成分和植物化學(xué)物質(zhì),具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)和抗癌等作用[1-4]。產(chǎn)自熱帶和亞熱帶地區(qū),在我國(guó)主要在廣東、海南、廣西等地區(qū)種植。因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和醫(yī)療價(jià)值,消費(fèi)者對(duì)于其需求有增無(wú)減[5]。番木瓜除可以鮮食外,還可加工成果醬和果汁等[6-8]。番木瓜籽是番木瓜鮮食或加工成相關(guān)產(chǎn)品后的副產(chǎn)物,通常將其作為廢棄物丟掉,不僅造成環(huán)境污染,而且浪費(fèi)資源。目前,有關(guān)番木瓜籽的活性成分如硫代葡萄糖苷[9]、異硫氰酸酯類(lèi)物質(zhì)[10]、多酚[11]等都有相關(guān)報(bào)道,番木瓜籽粗提取也有很多功能特性,如抗氧化活性等[12-13],番木瓜籽中油脂的研究也有很多文獻(xiàn)報(bào)道[14-19]。

植物蛋白質(zhì)的提取目前主要為堿溶酸沉法,反膠束萃取技術(shù)在植物蛋白質(zhì)的提取中也有相關(guān)的報(bào)道[20]。王標(biāo)詩(shī)等[21]報(bào)道了堿溶酸沉法提取番木瓜籽中蛋白質(zhì)并對(duì)其功能性質(zhì)進(jìn)行了探討;馬若影等[22]也研究了番木瓜籽蛋白質(zhì)超聲輔助提取以及超聲協(xié)同微波輔助提取工藝及其性質(zhì)進(jìn)行了研究;Parniakov等[23]報(bào)道了脈沖電能輔助水提取番木瓜籽中蛋白質(zhì)、多酚及碳水化合物等研究,但是通過(guò)這些研究發(fā)現(xiàn)番木瓜籽蛋白質(zhì)的提取率相對(duì)還不是很高,提取過(guò)程中也不能回收其他成分。目前,水酶法已在多種植物種籽中都得到了應(yīng)用,水酶法在提取蛋白質(zhì)的同時(shí)可以有效的回收油料中其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[24],如油脂等,具有廣闊的市場(chǎng)前景。番木瓜籽中還含有一定量的蛋白質(zhì),可作為植物蛋白質(zhì)的良好來(lái)源,但是目前對(duì)于番木瓜籽中的蛋白質(zhì)的研究鮮有報(bào)道。有關(guān)水酶法提取番木瓜籽蛋白質(zhì)還未見(jiàn)報(bào)道。

為此,本論文以番木瓜籽為研究對(duì)象,通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化了水酶法提取番木瓜籽中蛋白質(zhì)的工藝條件,以期為番木瓜的綜合開(kāi)發(fā)高值化利用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

番木瓜(九成熟) 購(gòu)于當(dāng)?shù)厮袌?chǎng),產(chǎn)地為湛江;中性蛋白酶(20萬(wàn)U/g,pH7.0～7.8,40 ℃) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;堿性蛋白酶(20萬(wàn)U/g,pH8.5～10.5,50～60 ℃) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;木瓜蛋白酶(20萬(wàn)U/g,pH6.0～7.0,55～65 ℃) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;纖維素酶(20萬(wàn)U/g,pH4～5.5,50～60 ℃) 阿拉丁試劑(上海)有限公司;其他化學(xué)試劑 均為分析純。

DFY-800搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司;DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;KDN-103F自動(dòng)定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;HC-3518高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;BCD-256KFA冰箱 青島海爾股份有限公司;FA1004N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;pHS-3C精密pH計(jì) 上海雷磁儀器廠;HYP-1004消化爐 上海纖檢儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 番木瓜切開(kāi)取籽,經(jīng)清洗干凈后在60 ℃恒溫干燥箱中干燥約10 h,用粉碎機(jī)粉碎并60目過(guò)篩,備用。

1.2.2 水酶法提取番木瓜籽蛋白質(zhì) 稱(chēng)取一定量的番木瓜籽于干凈的燒杯中,按照一定的料液比加入水,按一定的加酶量加入某種酶,在一定的溫度、一定的pH下水解一段時(shí)間,水解后于90 ℃條件下處理10 min進(jìn)行滅酶,然后在4000 r/min離心30 min,濾渣用清水清洗后再在4000 r/min的離心機(jī)下常溫離心30 min,合并濾液和清洗液,去掉上層油脂層后得到酶解液,用于蛋白質(zhì)提取率的測(cè)定。

1.2.3 酶種類(lèi)的選擇 稱(chēng)取一定量的番木瓜籽粉到干凈燒杯中,按料液比1∶15 (g/mL)加水,分別添加中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶,按1.5%的加酶量在各種酶的最適溫度和pH條件下(中性蛋白酶pH7.5,40 ℃;堿性蛋白酶pH9.5,55 ℃;木瓜蛋白酶pH6.5,60 ℃;纖維素酶pH5.0,55 ℃)酶解3 h,90 ℃條件下處理10 min進(jìn)行滅酶,然后在4000 r/min常溫離心30 min,測(cè)定酶解液蛋白質(zhì)含量?？瞻自囼?yàn)：自然pH和常溫下，不加蛋白酶處理，其他相同。以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo)評(píng)價(jià)各種酶的提取效果。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 在篩選出最佳酶的基礎(chǔ)上,按照1.2.2的方法,以蛋白質(zhì)提取率為指標(biāo),在pH為7.5,40 ℃下,以1.5%的用酶量添加木瓜蛋白酶酶解3 h,探討不同料液比(1∶11、1∶13、1∶15、1∶17、1∶19、1∶21)對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響;以1.5%的用酶量添加木瓜蛋白酶,在pH為7.5下,酶解3 h,探討不同溫度(30、35、40、45、50、55、60 ℃)對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響;在pH為7.5、40 ℃下,酶解3 h,探討木瓜蛋白酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%)對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響;以1.5%的用酶量添加木瓜蛋白酶,在pH為7.5、40 ℃下進(jìn)行酶解,探討酶解時(shí)間(2、3、4、5、6 h)對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響;以1.5%的用酶量添加木瓜蛋白酶,在40 ℃下酶解3 h,探討不同pH(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化木瓜蛋白酶在料液比為1∶19下提取番木瓜籽蛋白質(zhì)的工藝參數(shù)。以pH、酶添加量、溫度、時(shí)間為影響因素,以蛋白質(zhì)提取率為試驗(yàn)指標(biāo),響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.6 蛋白質(zhì)提取率的測(cè)定 蛋白質(zhì)測(cè)定方法為凱氏定氮法,參考GB 5009.5-2010。

蛋白質(zhì)提取率(%)=酶解液中蛋白質(zhì)的含量(g)/樣品質(zhì)量(g)×樣品中粗蛋白的含量(%)×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)量3次,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示,數(shù)據(jù)之間的顯著性差異采用SPSS軟件進(jìn)行分析。響應(yīng)面法采用Design Expert軟件中的Box-Behnken進(jìn)行設(shè)計(jì),數(shù)據(jù)分析采用Design Expert軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定結(jié)果

經(jīng)凱氏定氮法分析測(cè)定可知,番木瓜籽中的粗蛋白質(zhì)含量為26.21%±0.15%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,鄧楚津等[25]研究結(jié)果表明番木瓜籽中粗蛋白質(zhì)的含量為24.91%,Marfo等[26]研究結(jié)果表明番木瓜籽中蛋白質(zhì)含量為27.8%,Briones-Labarca等[27]研究結(jié)果表明番木瓜籽(樣品濕度為3.5%時(shí))中蛋白質(zhì)含量為31.84%±0.03%,去除水分約為28.34%,這些結(jié)果均在24%～29%,本試驗(yàn)的結(jié)果在此范圍內(nèi),產(chǎn)生的差別的原因可能由于番木瓜來(lái)源、品種和成熟度等不同所致。

2.2 酶的選擇

各種酶對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響結(jié)果如圖1所示。水酶法提取過(guò)程中酶的選擇至關(guān)重要。從圖1可看出,在各種酶的最適條件下添加木瓜蛋白酶時(shí),蛋白質(zhì)的提取率高于其他酶,而添加中性蛋白酶與堿性蛋白酶時(shí),蛋白質(zhì)的提取率非常接近,沒(méi)有顯著性差異(p<0.05),他們與木瓜蛋白酶和纖維素酶之間差異顯著(p<0.05)。木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶的最適pH均遠(yuǎn)離番木瓜籽蛋白的等電點(diǎn)(約3.3),不同程度上提高了蛋白質(zhì)在體系中的溶解度,從而易于蛋白酶的作用[24],相對(duì)而言，木瓜蛋白酶效果更好。而纖維素酶只對(duì)細(xì)胞壁具有破壞作用,酶不能完全接觸到蛋白質(zhì)等物質(zhì),提取率較低,由于木瓜蛋白酶也是常用的水解酶之一,因此選擇木瓜蛋白酶作為最佳用酶。

圖1 酶的種類(lèi)對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取的影響Fig.1 Effects of different enzymes on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 料液比對(duì)番木瓜蛋白質(zhì)提取率的影響 料液比對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,總體上隨著料液比的增大,番木瓜蛋白質(zhì)的提取率不斷增大;當(dāng)料液比在1∶11～1∶15時(shí),番木瓜蛋白質(zhì)提取率增加較快;料液比低于1∶15時(shí),提取率相對(duì)較小,這是因?yàn)榱弦罕鹊蜁r(shí),體系中水量有限,可以溶解的蛋白質(zhì)量也有限[24];之后隨著料液比的增加提取率增加相對(duì)較為緩慢,達(dá)到1∶19后基本上不增加,可能由于溶劑過(guò)多,對(duì)蛋白質(zhì)有一定的稀釋作用,故選擇以1∶19做為最佳料液比。

圖2 料液比對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.2 Effects of material/solvent ratio on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.3.2 溫度對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響 溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,在30～50 ℃時(shí),隨著溫度的提高,番木瓜蛋白質(zhì)的提取率增大;當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí),提取率達(dá)到最大值80.63%;當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃后,提取率隨著溫度的提升而下降,這是由于木瓜蛋白酶在超過(guò)50 ℃時(shí)使其偏離其最適溫度,導(dǎo)致提取率降低。因此選擇50 ℃作為酶解溫度。

圖3 溫度對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.3.3 酶添加量對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響 酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,在酶添加量為1.5%～2.0%之間時(shí),提取率增大速度最快,提取率最大為84.70%,當(dāng)用酶量超過(guò)2.0%時(shí),提取率開(kāi)始緩慢下降,進(jìn)一步增加酶用量,提取率不會(huì)提高,這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)受到酶的過(guò)度水解,空間結(jié)構(gòu)受到破壞[28]。再者,考慮到酶的價(jià)格較高,酶用量過(guò)高加大產(chǎn)品的成本,因此選擇最佳加酶量為2.0%。

圖4 酶添加量對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取的影響Fig.4 Effects of enzyme amount on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.3.4 酶解時(shí)間對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響 酶解時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響結(jié)果如圖5所示。由圖5可知,在提取時(shí)間為2～3 h時(shí),蛋白質(zhì)提取率增加較快,之后3～4 h時(shí)增加過(guò)緩,4 h后增加非常緩慢,到5 h達(dá)到最大值83.38%,之后反而略有降低,這是因?yàn)榈孜镫S酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷減少,酶解產(chǎn)物會(huì)對(duì)酶解反應(yīng)起到一定的抑制作用[29]。綜合考慮后,選擇5 h為最佳酶解時(shí)間。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取的影響Fig.5 Effects of time on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.3.5 酶解pH對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響 酶解pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率影響結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,pH從6.5增加到7.0,蛋白質(zhì)提取率也隨之增大,當(dāng)pH為7時(shí),有最大值84.71%,當(dāng)pH從7.0增加到8.0時(shí),提取率明顯降低,這是由于在pH為7時(shí)接近于此條件下的最適pH,此時(shí)酶活性最高,酶解蛋白的能力也最強(qiáng),因此選擇最佳pH為7。

圖6 pH對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率影響Fig.6 Effects of pH on the extraction rate of protein from the papaya seed

2.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化水酶法提取番木瓜籽蛋白質(zhì)的工藝

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以pH、加酶量、溫度、時(shí)間為影響因素變量,以蛋白質(zhì)提取率為試驗(yàn)指標(biāo),通過(guò)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案按表1進(jìn)行四因素三水平設(shè)計(jì)試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and resultsfor response surface analysis

對(duì)表2的數(shù)據(jù)在Design Expert上進(jìn)行分析得到擬合方程如下:

由Design Expert軟件進(jìn)行回歸及方差分析結(jié)果如表3所示。對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果表明模型的總回歸也極顯著(p<0.01),其決定系數(shù)R2為0.9975,這說(shuō)明該模型在試驗(yàn)范圍內(nèi)擬合度較高。二次回歸方程可用于對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行可靠分析和預(yù)測(cè)[29]。對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行失擬檢驗(yàn),顯示其失擬性呈不顯著(p>0.05),說(shuō)明該模型在試驗(yàn)范圍內(nèi)擬合度也是比較高的。對(duì)該數(shù)學(xué)模型的回歸系數(shù)檢驗(yàn)可知:四個(gè)因素對(duì)試驗(yàn)的影響極顯著(p<0.01),而交互項(xiàng)中的交互影響均為極顯著(p<0.01)。通過(guò)F值的大小判斷可得各個(gè)因素對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響力為X3>X4>X2>X1,即溫度>酶解時(shí)間>pH>酶添加量。

表3 Design Expert軟件回歸模型和方差分析結(jié)果Table 3 Results of regression and variance analysis by Design Expert software

2.4.2 響應(yīng)面分析與最優(yōu)條件的確定 三維響應(yīng)面和等高線圖是回歸方程的圖形表現(xiàn)形式,可用來(lái)表示測(cè)試變量和響應(yīng)值與各變量水平之間的相互作用關(guān)系。通過(guò)圖7～圖12中6組響應(yīng)面及等高線的形狀來(lái)分析酶添加量、酶解pH、酶解溫度和酶解時(shí)間4個(gè)主要因素間的交互作用對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),響應(yīng)面圖呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),酶添加量和pH(X1X2)、酶添加量和溫度(X1X3)交互作用較其它交互作用更強(qiáng),這與方差分析結(jié)果基本一致。

從圖7～圖12可看出,三維圖總體趨勢(shì)為向上凸起,說(shuō)明該數(shù)學(xué)模型具有最大值。利用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析,并對(duì)擬合的回歸方程進(jìn)行計(jì)算,預(yù)測(cè)水酶法提取番木瓜籽蛋白質(zhì)的最佳工藝條件當(dāng)X1=2.04,X2=6.97,X3=49.22,X4=5.38時(shí),即酶添加量為2.04%,pH為6.97,溫度為49.22 ℃,酶解時(shí)間為5.38 h時(shí),理論提取率最大為85.03%。由于實(shí)驗(yàn)條件限制,將該條件修訂為酶添加量為2.0%,pH為7.0,溫度為49 ℃,酶解時(shí)間為5.0 h時(shí),對(duì)該條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),實(shí)際測(cè)得的結(jié)果為84.96%±0.13%,軟件在該點(diǎn)的估計(jì)值為84.94%,與預(yù)測(cè)值相比,誤差僅為0.08%,接近預(yù)測(cè)值,表明在該試驗(yàn)?zāi)Ｐ拖碌玫降淖罴压に嚄l件具有較高的可靠性,可以用于預(yù)測(cè)水酶法提取番木瓜籽蛋白質(zhì)的工藝條件。

圖7 酶添加量和pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響響應(yīng)面和等高值圖Fig.7 Response surface and contour of effect of enzymes amount and pH on the extraction rate of protein from papaya seed

圖8 溫度和酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響響應(yīng)面和等高值圖Fig.8 Response surface and contour of effect of enzymes amount and temperature on the extraction rate of protein from the papaya seed

圖9 時(shí)間和酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響響應(yīng)面和等高值圖Fig.9 Response surface and contour of effect of enzymes amount and extraction time on the extraction rate of protein from the papaya seed

圖10 溫度和pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響響應(yīng)面和等高值圖Fig.10 Response surface and contour of effect of temperature and pH on the extraction rate of protein from the papaya seed

圖11 時(shí)間和pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響響應(yīng)面和等高值圖Fig.11 Response surface and contour of effect of time and pH on the extraction rate of protein from the papaya seed

圖12 溫度和時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響響應(yīng)面和等高值圖Fig.12 Response surface and contour of effect of time and temperature on the extraction rate of protein from the papaya seed

3 結(jié)論

本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了水酶法提取番木瓜籽蛋白質(zhì)的工藝條件。最終得出最佳工藝條件為:使用木瓜蛋白酶在料液比為1∶19,酶添加量為2.0%,pH為7.0,溫度為49 ℃,酶解時(shí)間為5 h,此時(shí)番木瓜籽蛋白質(zhì)的提取率最高為84.96%±0.13%。四個(gè)因素對(duì)番木瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響為溫度>酶解時(shí)間>pH>酶添加量。對(duì)番木瓜籽的高值化綜合開(kāi)發(fā)利用,不僅有利于解決廢棄物造成的環(huán)境污染問(wèn)題,還將帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。