, ,, ,,,2,3,*

(1.四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院,四川成都 610065;2.皮革化學(xué)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610065;3.國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心,四川瀘州 646000)

釀酒大曲既是中國傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)過程必需的發(fā)酵劑和粗酶制劑,又是重要的釀酒原料,在白酒的釀造過程中,影響微生物群落的繁殖與代謝的同時(shí),也與基酒獨(dú)特風(fēng)味的形成密切相關(guān)[1-2]。大曲的群落及風(fēng)味特征主要取決于環(huán)境溫度和濕度等參數(shù)。這些參數(shù)在制曲過程中對群落結(jié)構(gòu)的定向馴化,對群落代謝調(diào)控及產(chǎn)物的形成具有重要的作用。醬香型大曲群落中優(yōu)勢菌群組成類似其所用的高溫大曲,與所用原料中的優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)類似。二者的優(yōu)勢細(xì)菌都是芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和鏈霉菌(Streptomyces)[3-6]等,豐度最高之一的Bacillus分泌的代謝產(chǎn)物包括水解酶類和吡嗪類等,后者對醬香型大曲酒獨(dú)特風(fēng)味形成的貢獻(xiàn)顯著[7-10]。疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)、曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、漢森酵母屬(Hansenula)、念珠菌(Candida)和畢赤酵母屬(Pichia)則是其優(yōu)勢真菌[11],其豐度對生物活性組分(如多種水解酶等)的影響顯著[12]。王曉丹等[13]對貴州省三個(gè)醬香型大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的高通量測序結(jié)果表明,高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)的豐度最高,Bacillus和Scopulibacillus次之,與已有的報(bào)道略有不同,如Bacillus被認(rèn)為豐度是最高[5-6],或未檢出Thermoactinomyces[14],可能與檢測方法與條件有關(guān)。

中國赤水河流域星羅密布醬香型白酒企業(yè),生產(chǎn)方法相似,但產(chǎn)品風(fēng)格迥異,可能是大曲群落及代謝組分的差異所致。本文敘述了基于高通量測序技術(shù)，研究生產(chǎn)區(qū)域、企業(yè)、場地及陳曲時(shí)間不同樣品的微生物群落組成的差異,經(jīng)聚類和非度量多維測度分析(non-metric multidimensional scaling analysis,NMDS)等方法揭示其群落結(jié)構(gòu)的時(shí)空性特征的結(jié)果，以期為傳承和優(yōu)化醬香大曲生產(chǎn)工藝奠定重要方法學(xué)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

MBQ(茅臺(tái)鎮(zhèn)大曲) 取自貴州省懷仁市茅臺(tái)鎮(zhèn)的著名醬香型白酒集股份有限公司;MEQ(習(xí)酒鎮(zhèn)大曲) 取自上述集團(tuán)公司在貴州省習(xí)水縣習(xí)酒鎮(zhèn)生產(chǎn)基地;LEQ(二郎鎮(zhèn)大曲)、LGQ(黃荊壩大曲) 分別取自四川省古藺縣二郎鎮(zhèn)(與習(xí)酒鎮(zhèn)是隔赤水河相鄰)某著名醬香型白酒股份有限公司兩個(gè)不同生產(chǎn)基地;XTQ(仙潭鎮(zhèn)三月大曲)、XXQ(仙潭鎮(zhèn)六月大曲) 取自四川省古藺縣太平鎮(zhèn)(與二郎鎮(zhèn)僅距30km)的大型醬香型白酒企業(yè)的陳曲時(shí)間分別是3個(gè)月和6個(gè)月的樣品;Tris-HCl、EDTA、CTAB、SDS、纖維素酶、蝸牛酶、溶菌酶和蛋白酶K(分析純) 均購買于上海生工生物工程有限公司(中國上海)。

PCR儀 美國S 100 TM Thermal Cycler Bio-Rad公司;Gel DocTM XR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;TGL 16M高速冷凍離心機(jī) 湘麓離心機(jī)儀器公司;手提式高壓滅菌鍋 上海醫(yī)療衛(wèi)生儀器廠;Illumina Miseq測序儀 美國Illumina;Nanodrop NC2000微量UV分光光度儀 Thermo Scientific(上海)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 為了解MBQ在醬香型大曲的特殊性,參考DB52/T 871-2014,從其曲表、黑臺(tái)層、曲底和曲心等4個(gè)顏色不同部位取樣;其余5種不同樣品則分別從其曲表和曲心取樣。采用4點(diǎn)取樣法分別從樣品部位的各位點(diǎn)取樣,混合均勻后取100 g用于分析。各樣品的詳細(xì)信息見表1。

表1 各樣品信息Table 1 Information of various samples

1.2.2 DNA提取 樣品的菌體收集、DNA提取參考Zhang等[15]方法完成。主要步驟如下:稱取5 g大曲和3 g玻珠置于50 mL滅菌的離心管中,加入25 mL的磷酸鹽緩沖溶液(PBS,0.1 mol/L,pH8.0),渦旋5 min,離心10 min(1000 r/min,4 ℃)收集上清液,重復(fù)3次,匯集所得的上清液。然后將其離心10 min(12000 r/min,4 ℃)收集菌團(tuán),-20 ℃保存待用。凍融研磨加酶助法提取DNA。DNA提取液為 0.1 mol/L Tris-HCL(含0.1 mol/L EDTA,1.5 mol/L NaCl,1% CTAB,pH=8.0),混合酶液由纖維素酶(75 mg/mL)、蝸牛酶(50 mg/mL)和溶菌酶(50 mg/mL)組成。提取的DNA經(jīng)2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測和微量UV分光光度儀定量。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 分別用通用引物520F/802R和ITS2/ITS5擴(kuò)增細(xì)菌V3-V4和真菌ITS1變異區(qū)。PCR體系:0.5 μL DNA聚合酶,5 μL 5×buffer,5 μL 5×High GC buffer,0.5 μL DNTP(10 mmol/L),1 μL DNA模板,1 μL正向引物(10 mmol/L),1 μL反向引物(10 mmol/L),11 μL ddH2O。PCR程序:98 ℃,30 s;(98 ℃,15 s;50 ℃,30 s;72 ℃,30 s)×27,72 ℃,5 min,4 ℃,反向。

1.2.4 樣品PCR純化及測序 委托上海派森諾生物科技有限公司對PCR產(chǎn)物純化,并使用Illumina MiSeq 2×300 platform(Illumina Inc,San Diego.CA)測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用QIIME(v1.8.0,1http://qiime.org/)完成過濾及去除嵌合體,具體操作是:去除5′端引物錯(cuò)配堿基>1的序列和含有N(模糊堿基)的序列;去除含量連續(xù)相同堿基數(shù)>8的序列,及USEARCH(v5.2.236,http://www.drive5.com/usearch)推測的嵌合體。經(jīng)UCLUST(v1.1.579)對相似長度≥150 bp及相似度≥97%聚類為相同的操作單元(operational taxonomic units,OUT),隨后根據(jù)Greengenes(Release 13.8 http://greengenes.secondgenome.com)和UNITE數(shù)據(jù)庫(Release 5.0,https://unite.ut.ee/),進(jìn)行不同水平的分類(界、門、綱、目、科、屬、種)。分別用Mothur(v1.31.2)和QIIME(V1.8.0,http://qiime.org/)評估OTUs豐度≥0.5%α-和β-多樣性。應(yīng)用R軟件(https://www.r-project.org/)完成熱圖,實(shí)現(xiàn)可視化及聚類和非度量多維測度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR電泳結(jié)果

如圖1所示,樣品中微生物總DNA的真菌ITS1和細(xì)菌V3-V4變異區(qū)的PCR結(jié)果的條帶清晰度和DNA電泳位置分別在300、500 bp左右,滿足后續(xù)檢測結(jié)果的要求。

圖1 ITS1和V3-V4基因片段區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results of ITS and V3-V4 gene region注:(a)和(c):ITS1基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果;(b)和(d):V3-V4基因片段區(qū)擴(kuò)增結(jié)果。

2.2 群落α和β多樣性的時(shí)空性特征

本研究中的菌株序列已經(jīng)提交到GenBank(美國)數(shù)據(jù)庫,申請得到國際基因庫接受號(hào):SRP135846。

如表2所示,14個(gè)樣品有效的細(xì)菌和真菌序列分別為36082～51255和48640～81082,高質(zhì)量序列平均數(shù)分別是37912、60641,是有效平均序列的85.97%和96.86%。微生物累積曲線隨著測序的樣本數(shù)的增加漸變平緩(圖2),表明測序樣本數(shù)能反映其群落結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)。不同生產(chǎn)區(qū)域、產(chǎn)地和陳曲時(shí)間及部位的樣品間α多樣性差異明顯(表3)。除了MBQ和LEQ,曲心中細(xì)菌的物種豐富度指數(shù)高于曲表;除了MEQ,曲心中真菌的物種豐富度指數(shù)也高于曲表。相應(yīng)地,除了MBQ,曲心中的細(xì)菌多樣性指數(shù)略高于曲表,MBQ和LEQ等樣品的曲心中的真菌多樣性指數(shù)也略高于曲表。陳曲過程中(從3個(gè)月延長到6個(gè)月)曲心的細(xì)菌豐富度和多樣性指數(shù)都增高,而曲表則相反,同時(shí),曲心和曲表的真菌物種豐富度指數(shù)都略減。

圖2 樣品的細(xì)菌(a)和真菌物種(b)累積曲線Fig.2 Specaccum curve based on the observed bacterial(a)and fungal(b)quantity

表2 不同醬曲樣品之間高質(zhì)量真菌和細(xì)菌序列數(shù)的差異Table 2 Difference of high quality sequence based on 16S rRNA and ITS

表3 樣品間微生物群落的α-多樣性的差異Table 3 Difference of α-diversity among samples

測序結(jié)果表明,這些樣品的細(xì)菌包括6個(gè)門,分別是厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和柔膜菌門(Tenericutes),真菌則包括子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、接合菌類(Zygomycota)及未確定群類。其中Firmicutes和Ascomycota分別是豐度最高細(xì)菌和真菌。不同種類大曲的曲心和曲表間的細(xì)菌和真菌群落差異明顯。Firmicutes和Proteobacteria的豐度之和超過細(xì)菌豐度的89.30%,而Ascomycota、Basidiomycota的豐度之和高于真菌豐度的94.04%。豐度高于1%以上的屬水平種類熱圖聚類分析的結(jié)果(圖3)表明,曲心和曲表群落結(jié)構(gòu)差異明顯。MBH的細(xì)菌群落單獨(dú)聚為一類,而其真菌群落則與MBA和XTH的聚為一類,其中MBH和MBA則又聚為一亞類。樣品的細(xì)菌聚類的另一族中,曲心和曲表分別歸類為兩個(gè)亞族,其中LEA和LGA聚為一個(gè)子族,XXA和XTA聚在一起,曲心則僅有XXH和MEH聚在一起。同樣地,真菌群落熱圖分析中另一族的樣品中,XXA和XTA相鄰,且與LGH聚在同一子族,LEH和LEA相鄰,且與XXH聚在一小類中。顏色由深至淺表示的樣品間,各種屬水平微生物的OTU相對含量大小表明其差異性分布特點(diǎn)。

圖3 不同樣品的優(yōu)勢菌(OUT>1%)的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of dominant microbial community(OUT>1%)among the various samples 注:(a):細(xì)菌,(b):真菌;*表示該微生物科中某一特定的屬(目前沒有統(tǒng)一命名)。

NMDS分析的結(jié)果進(jìn)一步揭示了樣品群落結(jié)構(gòu)的差異。除茅臺(tái)原產(chǎn)地大曲曲心,其余5種大曲樣品的曲心的真菌和細(xì)菌物種種類組成類似,但曲表樣品的組成則呈現(xiàn)較大差異(非加權(quán)NMDS,圖4a和圖4c),LGA和MEA較為近似。但各物種數(shù)量則是在曲心間差異顯著,而曲表間類似(加權(quán)NMDS,圖4b和圖4d)。MBQ中微生物群落中物種數(shù)量及各屬水平微生物物種數(shù)及數(shù)量均差異明顯。

圖4 NMDS排序結(jié)果圖Fig.4 Non-metric multidimensional ordination result graph注:(a)細(xì)菌非加權(quán);(b)細(xì)菌加權(quán);(c)真菌非加權(quán);(d)真菌加權(quán)。

2.3 群落中的優(yōu)勢菌的時(shí)空性特征

在這些樣品中檢出了116個(gè)不同的細(xì)菌屬和61個(gè)的真菌屬,分別屬于20個(gè)細(xì)菌目,21個(gè)真菌目(圖5)。優(yōu)勢的細(xì)菌屬(OTU>1%)屬于芽胞桿菌目(Bacillales)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、放線菌目(Actinomycetales)和乳酸桿菌目(Lactobacillales)等4個(gè)不同的目,其豐度之和超過96.84%,與Wang等[4]和Liu等[5]的報(bào)道結(jié)果是一致的,但樣品間優(yōu)勢菌的豐度的差異明顯。除LEQ和LGQ以外,Bacillales和Lactobacillales分別在曲心和曲表中占優(yōu)勢,前者在曲心的比例為24.71%～68.59%,后者在曲表中為55.89%～80.91%。

曲表的優(yōu)勢細(xì)菌屬，其種類差異較小,腸球菌屬(Enterococcus)是除LGA和LEA外的優(yōu)勢菌(55.89%～80.91%),而腸桿菌科未定屬(Enterobacteriaceae_G,59.61%)和芽胞桿菌科未定屬(Bacillaceae_G,57.77%)分別是LEA和LGA中最優(yōu)勢的細(xì)菌屬。乳酸是Enterococcus和Enterobacteriaceae的主要代謝產(chǎn)物之一。乳酸不僅是乳酸酯前體,且具有抑制雜菌等作用,所以在醬香大曲酒生產(chǎn)過程中Enterococcus和Enterobacteriaceae的貢獻(xiàn)待深入研究。與曲表樣品不同,不同醬香型大曲曲心樣品中優(yōu)勢的細(xì)菌屬種類差異明顯。Bacillaceae_G是在曲心樣品中的主要優(yōu)勢菌,豐度為24.71%～68.59%,此外Bacillus、Staphylococcus和Thermoactinomyces等在取心中的豐度同樣較高,其中Bacillus是既能合成吡嗪類等醬香型大曲酒特殊組分的生物合成者[7,10,16],又產(chǎn)水解酶類[17]。雖然已在濃香和醬香型大曲及多種傳統(tǒng)發(fā)酵食品中檢出了Staphylococcus[18],但其作用尚待深入探討。Thermoactinomyces作為大曲中優(yōu)勢細(xì)菌[13,18-19],產(chǎn)生各種水解酶,如堿性磷酸酶、酯化酶、液化酶和磷酸水解酶等[20],在白酒釀造過程中具有重要的作用。

茅臺(tái)大曲的曲心樣品(MBH)中優(yōu)勢細(xì)菌包括Staphylococcus、Bacillus、動(dòng)球菌科未定屬(Planococcaceae_G)和Bacillaceae_G等,其豐度分別是38.70%、11.19%、4.33%和39.55%,后二者在在MEH也是優(yōu)勢菌屬,其豐度分別占66.32%和10.25%。在MBC中,片球菌屬(Pediococus)和Enterococcus豐度分別是66.12%和11.09%,而在MBD中,這二者及乳酸桿菌科未定屬(Lactobacillaceae_G)、明串珠菌科未定屬(Leuconostocaceae_G)的豐度分別是43.01%、22.16%、14.87%和16.33%。LEH中的Thermoactinomyces、Bacillaceae_G和Enterobacteriaceae_G的豐度分別是38.35%、30.95%和10.49%。LGH中的歐文氏菌屬(Rwinia)和Enterobacteriaceae_G的豐度分別是32.07%和27.06%。增加3個(gè)月時(shí)間后,曲心中優(yōu)勢細(xì)菌的構(gòu)成發(fā)生顯著變化,除Bacillaceae_G外,XTH的優(yōu)勢菌屬是Thermoactinomyces(15.52%),而在XXH中,Planococcaceae_G(10.87%)和Enterobacteriaceae_G(16.82%)是優(yōu)勢菌。

如圖5b所示,醬香型大曲中的優(yōu)勢真菌屬包括木霉屬(Trichoderma)、假絲酵母(Candida)、曲霉菌(Aspergillus)、嗜熱真菌屬(Thermomyces)、嗜熱子囊菌屬(Thermoacus)、擬青霉屬(Paecilomyces)和絲孢酵母屬(Trichosporon)等7個(gè)不同屬,其豐度在74.80%～97.88%間。乙醇、異戊醇和苯乙醇是Candida主要代謝產(chǎn)物[21],而包括蛋白酶和淀粉酶在內(nèi)的水解酶是Aspergillus是代謝產(chǎn)物,且這些真菌還產(chǎn)生多種揮發(fā)組分及前體[22]。Thermomyces、Thermoacus和Trichoderma等菌則與纖維素降解酶(纖維素酶及葡萄糖苷酶等)及淀粉水解酶(葡萄糖)的合成有關(guān)[23-25]。盡管Trichosporon在釀酒過程的作用尚不清楚,但產(chǎn)脂肪酶及酯化能力還是引人關(guān)注[26]。

圖5 樣品中優(yōu)勢種屬組成輪廓圖(OUT>1%)Fig.5 Dominant microbial community profiles in various samples(OUT>1%)注:a:細(xì)菌,b:真菌,*表示表示該微生物科中某一特定的屬(目前沒有統(tǒng)一命名)。

在MBH和MBA中,Aspergillus的豐度分別是32.61%和64.83%,此外在前者Candida(32.25%)和Trichoderma(16.79%)也是優(yōu)勢菌。Candida在MBC(75.87%)和MBD(43.27%)的豐度差異顯著,同時(shí)Thermomyces在后者的豐度是21.23%。由此可見,茅臺(tái)大曲中的Aspergillus、Candida、Trichoderma和Thermomyces等4個(gè)屬真菌為優(yōu)勢菌。同企業(yè)因生產(chǎn)區(qū)域及產(chǎn)地不同,其樣品的優(yōu)勢真菌豐度也有較大差異。如MBH的Trichoderma和Aspergillus的豐度分別是16.79%和32.61%,MEH中為45.58%和1.40%,在MBA和MEA中Trichosporon的豐度分別是6.57%和30.55%。類似的,LEQ和LGQ曲心和曲表樣品間Trichoderma、Aspergillus、Thermoacus和Paecilomyces的豐度也有較大差異。增長3個(gè)月陳曲時(shí)間,優(yōu)勢真菌的豐富度發(fā)生明顯改變,其中嗜熱真菌屬(Thermomyces)和嗜熱子囊菌屬(Thermoacus)的豐富度增加,木霉屬(Trichoderma)和絲孢酵母屬(Trichosporon)則減少。木霉屬(Trichoderma)在曲心中增高,但在曲表中則減少,假絲酵母(Candida)在曲心中顯著增高,但在曲表中略減少。

3 結(jié)論

應(yīng)用宏基基因測序技術(shù)剖析產(chǎn)地、不同企業(yè)、生產(chǎn)場地及陳曲時(shí)間對醬香型大曲群落組成及群落多樣性的特征,結(jié)果表明,醬香型大曲的優(yōu)勢細(xì)菌主要包括由Bacillales、Enterobacteriales、Lactobacillales和Actinomycetales等4個(gè)目,而優(yōu)勢真菌則是Saccharomycetales、Hypocreales、Eurotiales和Trichosporonales等4個(gè)目,茅臺(tái)大曲中Staphylococcus、Bacillus、Pediococus、Candida和Aspergillus的豐度高于其它5種大曲的,而其它5種大曲的群落結(jié)構(gòu)組成及多樣性也差異明顯,陳曲時(shí)間明顯地影響群落的多樣性。測序結(jié)果的NMDS分析表明,除茅臺(tái)原產(chǎn)地大曲曲心,各種大曲樣品的曲心的真菌和細(xì)菌物種種類組成類似,但優(yōu)勢物種種類差異較大;相反,曲表的微生物組成種類差異較大,但共有優(yōu)勢物種種類及豐度相似。其結(jié)果揭示了醬香型大曲的微生物群落具有顯著的時(shí)空性特征。