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(淮南師范學(xué)院生物工程學(xué)院,安徽淮南 232038)

纖孔菌屬(Inonotusspp.)是一類具有黃色至淺紅色橢圓形、無擬糊精擔(dān)孢子的一年生單系菌絲系統(tǒng)[1],該屬有80多個種[2],比較常見的有粗毛纖孔菌(I.hispidus)、斜生纖孔菌(I.obliquus)、柳生纖孔菌(I.pruiosus)、薄皮纖孔菌(I.cuticularis)和輻射狀纖孔菌(I.radiatus)等[3]。粗毛纖孔菌(Inonotushispidus),主要寄生在榆樹、桑樹、蘋果木、櫟樹、水曲柳、桃樹等闊葉樹的樹干上[4],為桑黃的一種,是一種珍貴的藥用真菌,在我國東北地區(qū)用于治療消化不良等胃病[5],在新疆南部主要用于治療癌癥、糖尿病、痛風(fēng)和關(guān)節(jié)炎等[6],在德國民間用作瀉藥,具有凈腸通便的作用[4]。

目前關(guān)于粗毛纖孔菌的研究主要集中在馴化栽培[7-8]、其生物活性研究主要集中在降血脂[9]、抗腫瘤[10-12]方面,活性成分研究主要集中在三萜[13-15]和多糖[16]的提取、分離和活性研究,關(guān)于多酚類物質(zhì)的分離純化及活性研究相對較少。而多酚類物質(zhì)是一類重要生物活性成分,具有多種生理活性。昝立峰[17]在寄生于新疆南部古老桑樹上的粗毛纖孔菌子實體中分離鑒定出15個化合物,其中包括9個多酚類物質(zhì),牛奶樹堿、Hispolon、Inonotusin A、Inonotusin B、原兒茶酸和原兒茶醛等。其中主要化合物Hispolon可以有效地清除DPPH·、ABTS+·、·OH多種自由基[18-19],具有良好的抗氧化活性。

本文以采自塔吉克斯坦沙拉土日當(dāng)?shù)厣渖系囊吧｜S子實體為研究對象,對菌株進(jìn)行分類鑒定,對其抗氧化活性和抑菌活性及其與總多酚、總黃酮之間的相關(guān)性進(jìn)行較為系統(tǒng)地研究,為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生桑黃子實體(SH) 采集于塔吉克斯坦沙拉土日,分離自當(dāng)?shù)厣?粉碎,常溫保存?zhèn)溆?草莓灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea)、大腸桿菌(Bacilluscoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 淮南師范學(xué)院生物工程學(xué)院微生物實驗室;真菌基因組DNA快速抽提試劑盒(SK8230) 生工生物工程(上海)有限公司;Fungi Identification PCR Kit(RR178) TAKARA公司;福林酚(Folin-Cilcalteu)試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH),2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、水溶性維生素E(Trolox) Sigma公司;沒食子酸、蘆丁 上海融禾醫(yī)藥科技有限公司;蛋白胨、牛肉膏、瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

KQ-400B型超聲波清洗機 昆山超聲儀器有限公司;LDZW-60KCS-ll型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械;BSC-250型恒溫恒濕箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州予華儀器制造有限公司;SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種分子生物學(xué)鑒定 取20 mg干燥的子實體用液氮研磨成粉末,加入緩沖液和β-巰基乙醇,振蕩混勻,于65 ℃水浴中裂解。按照試劑盒說明提取基因組DNA,最后提取的基因組DNA溶于100 μL TE緩沖液,于-20 ℃保存?zhèn)溆?。ITS區(qū)序列擴增體系(50 μL):模板DNA 1 μL,PCR預(yù)混料25 μL,正向引物0.5 μL,反向引物0.5 μL,重蒸水23 μL。PCR擴增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min,50～55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán);72 ℃末端延伸5 min,4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，送通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司進(jìn)行測序。所得序列通過BLAST(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行序列相關(guān)性分析,提交到GenBank獲得序列號,利用Clustal_X軟件對所得序列進(jìn)行校正和比對分析,采用MEGA 4.0軟件、以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[8]。

1.2.2 子實體提取物制備 參考馬迪等[20]的方法略作修改。稱取桑黃子實體粉末 0.5 g 4份,分別加入20 mL甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯、氯仿,在60 Hz,40 ℃條件下超聲提取30 min,提取液用定性分析濾紙進(jìn)行真空抽濾,收集濾液,將殘渣按照相同條件再提取2次,合并3次收集到的濾液,于45 ℃下減壓蒸發(fā)濃縮至干,分別溶于5 mL二甲基亞砜(DMSO)得到4種不同溶劑提取物濃縮液(100 mg/mL),4 ℃保存,備用。

1.2.3 總多酚含量測定 采用福林酚試劑法。參考Cai等[21]的方法,稍作修改。取1.0 mL樣液于小試管中,加入5.0 mL蒸餾水,1.0 mL 0.2 mol/L福林酚試劑,3.0 mL 7.5%Na2CO3,搖勻后置于25 ℃下避光反應(yīng)2 h,765 nm處測定吸光值。空白作對照調(diào)零,以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(0～0.04 mg),結(jié)果換算成每克子實體相對于沒食子酸的量(mg沒食子酸/g),實驗重復(fù)3次。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=11.236X+0.007,R2=0.9991。

1.2.4 總黃酮含量測定 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法。參考劉艷芳等[22]的方法,稍作修改。取3.0 mL樣液于試管中,加入0.2 mL 5%(w/v)亞硝酸鈉溶液,搖勻后靜置反應(yīng)6 min,再加入0.2 mL 10%(w/v)硝酸鋁搖勻后靜置反應(yīng)6 min,再加入0.6 mL 4%(w/v)氫氧化鈉,搖均后靜置反應(yīng)15 min,510 nm下測定吸光值,空白作對照調(diào)零。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果換算成每克子實體相當(dāng)于蘆丁的量(mg蘆丁/g),標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.0233X+0.0006,R2=0.9993。

1.2.5 DPPH· 清除能力的測定 參考Vieira等[23]的方法,取2.0 mL 0.05 g/L DPPH無水乙醇溶液,加入2.0 mL樣品液,搖勻,置于25 ℃水浴中避光反應(yīng)20 min,以蒸餾水調(diào)零,于517 nm處測定吸光度值。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,各溶劑提取物的自由基清除能力以Trolox當(dāng)量抗氧化能力(Tolox equivalent antioxidant activity,TEAC)表示,它代表與1 g子實體具有相同抗氧化能力所需Trolox的毫克數(shù)(mg Trolox/g),標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-0.0276X+0.8217,R2=0.9962。

1.2.6 鐵離子還原能力(FRAP)測定 鐵離子還原能力測定方法參考李昕等[24]的方法,將0.1 moL/L醋酸鹽緩沖液(pH3.6)、10 mmoL/L TPTZ溶液(溶于40 mmoL/L鹽酸)、20 mmoL/L氯化鐵溶液按10∶1∶1混勻,得到 FRAP 工作液。取0.1 mL樣品溶液加入到2.45 mL FRAP工作液中,充分混合后避光反應(yīng)60 min,于593 nm處測定其吸光度。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,各溶劑提取物的FRAP用TEAC表示,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.1475X+0.0453,R2=0.9992。

1.2.7 ABTS+·清除能力的測定 參考陳志娜等[25]的方法,取7 mmol/L ABTS溶液5 mL,加入140 mmol/L過硫酸鉀溶液88 μL,室溫下避光放置12～16 h,使用前用無水乙醇調(diào)零,在734 nm處用無水乙醇將其吸光值調(diào)整至0.700±0.05,作為ABTS工作液備用。

取樣品液0.5 mL,加入3 mL ABTS工作液,搖勻后置于25 ℃水浴避光反應(yīng)30 min,用無水乙醇調(diào)零,在734 nm處測定吸光值。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,各溶劑提取物的自由基清除能力用TEAC表示,標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-0.0313X+0.6753,R2=0.9983。

1.2.8 抑菌活性測定 采用牛津杯法測定抑菌活性[26]。

1.2.8.1 菌種的活化及菌懸液的制備 將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌從斜面上接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,于37 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)16 h,再用無菌生理鹽水將菌液稀釋至107～108cfu/mL,振蕩均勻后備用。

草莓灰葡萄孢霉于恒溫培養(yǎng)箱中(溫度28 ℃,濕度85%)培養(yǎng)5 d,用接種環(huán)挑取少許孢子于裝有玻璃珠和10 mL無菌生理鹽水的三角瓶中,振蕩,采用血細(xì)胞計數(shù)法測定菌數(shù)[27],制成孢子濃度為104～105cfu/mL的孢子懸液,振蕩均勻后備用。

1.2.8.2 牛津杯法測定抑菌效果 參考王娣等[28]的方法,略作修改。取滅菌烘干的牛津杯(外徑8 mm、內(nèi)徑6 mm、高10 mm)置于已用100 μL菌懸液涂布均勻的培養(yǎng)皿中,用無菌微量移液器分別注入150 μL子實體不同溶劑提取物,于恒溫培養(yǎng)箱中(溫度28 ℃,濕度85%)培養(yǎng)12 h后,采用十字交叉法測定抑菌圈直徑。

1.3 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果采用3次平行實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 18.0軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析(One-way ANOVA),利用Duncan’s multiple range test方法進(jìn)行顯著性分析,選取p<0.05為顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)PCR擴增和序列測定,獲得菌株的ITS序列片段,GenBank登錄號為MG655159。進(jìn)一步經(jīng)過BLAST在線比對,與Inonotushispidus(EU282484.1)的相似性為99%,并利用MEGA 4.0軟件與相近種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,如圖1所示,確定菌種為粗毛纖孔菌(Inonotushispidus)。

圖1 基于SH菌株ITS序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree based on rDNA ITS sequences of SH

2.2 總多酚和總黃酮含量

粗毛纖孔菌不同溶劑提取物的總黃酮、總多酚含量測定結(jié)果見表1。從表1可以看出,粗毛纖孔菌不同溶劑提取物的總黃酮、總多酚含量存在顯著差異,總黃酮和總多酚含量從高到低的提取溶劑依次為甲醇、70%乙醇、乙酸乙酯、氯仿,其中甲醇提取物中的總黃酮含量為(14.78±0.16) mg蘆丁/g,總多酚含量為(67.42±1.41) mg沒食子酸/g。

表1 粗毛纖孔菌不同溶劑提取物的總黃酮、總多酚含量 Table 1 Total flavonoid and polyphenol of Inonotus hispidus by different solvents

2.3 抗氧化活性

不同抗氧化檢測方法的反應(yīng)機理不同,為得到可靠的結(jié)論,本實驗采用DPPH·清除能力、ABTS+·清除能力和FRAP法，對粗毛纖孔菌子實體不同溶劑提取物的抗氧化活性進(jìn)行評價,結(jié)果換算成Trolox當(dāng)量抗氧化能力(Tolox equivalent antioxidant activity,TEAC)[29]。由圖2可知,粗毛纖孔菌子實體不同溶劑提取物的抗氧化活性存在顯著性差異,4種不同溶劑提取物對ABTS+·清除能力從(9.35±0.19)到(116.08±0.24) mg Trolox/g,其中70%乙醇提取物的清除能力最強,氯仿提取物的最弱;4種不同溶劑提取物對鐵離子的還原能力從(11.20±0.26)到(126.24±3.02) mg Trolox/g,其中甲醇提取物的最強,氯仿提取物的最弱;4種不同溶劑提取物對DPPH·清除能力從(6.53±0.02)到(43.83±0.03) mg Trolox/g,其中70%乙醇提取物的最強,氯仿提取物的最弱。

圖2 粗毛纖孔菌不同溶劑提取物的抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity of extracts from Inonotus hispidus by different solvents注:小寫字母不同表示不同提取溶劑的相同測定指標(biāo)差異顯著(p<0.05)。

2.4 抗氧化活性與總多酚、總黃酮相關(guān)性分析

粗毛纖孔菌提取物的抗氧化活性與總多酚、總黃酮之間的相關(guān)性見表2。總多酚、總黃酮含量與FRAP法之間存在極顯著(p<0.01)正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.989和0.825,與錢驊等[30]的報道相似,其研究發(fā)現(xiàn)桑黃子實體的抗氧化活性(FRAP法)與多酚和黃酮含量呈線性正相關(guān)(R2為0.997和0.995)。總多酚含量與DPPH·和ABTS+·清除能力之間存在顯著(p<0.01)正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.622和0.695,而總黃酮含量與DPPH·和ABTS+·清除能力之間不相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)薄荷、嘉寶果葉片等不同溶劑提取物清除DPPH·和ABTS+·的清除能力與黃酮含量相關(guān)性較小[31-32],與本研究結(jié)果類似。此結(jié)果進(jìn)一步說明多酚類物質(zhì)是粗毛纖孔菌抗氧化能力的關(guān)鍵物質(zhì)。目前,從粗毛纖孔菌中分離出的具有抗氧化活性的酚類化合物主要有牛奶樹堿、inonotusin A和inonotusinB[33]。

表2 粗毛纖孔菌提取物的抗氧化活性與總多酚、總黃酮之間的相關(guān)性Table 2 Correlation coefficients of antioxidant activity between total polyphenol and total flavonoid extracts from Inonotus hispidus

2.5 抑菌活性

粗毛纖孔菌不同溶劑提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌以及草莓灰葡萄孢霉的抑制效果如表3所示。從表3可以看出,除氯仿提取物外,其余3種提取物對實驗所用的3種指示菌都具有良好的抑制效果,其中,甲醇提取物的抑菌活性最佳,70%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物次之。另外,各溶劑提取物對3種指示菌的抑制效果呈現(xiàn)一定的選擇性。其中,3種提取物對草莓灰葡萄孢霉的抑制效果均明顯強于細(xì)菌,且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果強于大腸桿菌。

表3 粗毛纖孔菌不同溶劑提取物的抑菌活性Table 3 Antimicrobial activity of extracts from Inonotus hispidus by different solvents

結(jié)合表1中各提取物中的總黃酮、總多酚含量可知,提取物中的多酚含量明顯高于黃酮含量,且甲醇提取物中的多酚含量最高,猜測抑菌活性可能與粗毛纖孔菌子實體提取物中的多酚類化合物有關(guān)。此結(jié)果與Liu等[34]和Benarous等[35]的研究一致,他們研究發(fā)現(xiàn)纖孔菌屬中的主要抑菌物活性物質(zhì)為蘆丁、綠原酸和牛奶樹堿等酚類化合物。

3 結(jié)論

本實驗以采集于塔吉克斯坦沙拉土日地區(qū)桑樹上的桑黃子實體為研究對象,利用rDNA ITS序列分析將其鑒定為粗毛纖孔菌(Inonotushispidus)。進(jìn)一步研究了其子實體不同溶劑提取物中的總黃酮、總多酚與抗氧化活性的相關(guān)性以及4種溶劑提取物的抑菌活性。結(jié)果表明,粗毛纖孔菌不同溶劑提取物中的總黃酮、總多酚、抗氧化活性和抑菌活性存在顯著差異,其中甲醇提取物中的總黃酮和總多酚含量最高,分別為(14.78±0.16) mg蘆丁/g和(67.42±1.41) mg沒食子酸/g。70%乙醇提取物的ABTS+·清除能力和DPPH·清除能力最強,甲醇提取物的鐵離子還原能力最強。

相關(guān)性分析顯示總多酚和總黃酮與FRAP法之間的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.989和0.825,極顯著(p<0.01)正相關(guān)?？偠喾优cABTS+·清除能力和DPPH·清除能力之間的相關(guān)系數(shù)為0.695和0.622,顯著相關(guān)(p<0.05),而總黃酮與ABTS+·清除能力和DPPH·清除能力之間不相關(guān),說明多酚類物質(zhì)對粗毛纖孔菌抗氧化活性起到了關(guān)鍵性作用。抑菌結(jié)果顯示,70%乙醇提取物和甲醇提取物表現(xiàn)出較好的抑菌效果,其中對草莓灰葡萄孢霉的抑菌效果最好(抑菌圈直徑>30 mm),其次是對金黃色葡萄球菌(抑菌圈直徑>15 mm),對大腸桿菌的抑菌效果最差(抑菌圈直徑>10 mm)。