,,培征,,*

(1.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院,海南?？?570228; 2.海南省林業(yè)科學(xué)研究所通什分所,海南五指山 572200)

海南苦丁茶(IlexkudingchaC. J. Tseng)屬冬青科苦丁茶冬青種,主要分布在我國(guó)南方等省[1]。海南苦丁茶含有苦丁皂甙、黃酮類、萜類、多酚類和多糖類等多種次生代謝產(chǎn)物,具有抗氧化、降血壓以及降脂減肥等多種功效[2-3]。Thuong等[4]發(fā)現(xiàn)4種茶冬青的乙酸乙酯組分中含有豐富的酚類化合物,與水提物相比具有顯著的自由基清除活性。農(nóng)朝贊等[5]研究了4種茶熊果酸對(duì)鼻咽癌細(xì)胞增殖的抑制作用。王新等[6]研究4種茶冬青的粗多糖KPS II 以及2種精多糖,具有濃度依賴性的羥基自由基清除活性。

白沙綠茶(Baisha green tea),屬山茶科山茶屬。據(jù)報(bào)道白沙綠茶富含維生素C、咖啡因、茶氨酸、表兒茶素、表沒食子兒茶素、沒食子酸酯等多種有效成分[7-8]。田博巖等[9]發(fā)現(xiàn)白沙綠茶具有一定的降血脂及護(hù)肝作用。李杰等[10]研究了海南白沙綠茶的甲醇提取物、乙醇提取物及水提物的抗氧化活性,認(rèn)為70%乙醇提取物的體外抗氧化能力較強(qiáng)。

海南大葉種(Camelliaassamicavar.assamicacv. Hainan-dayezhong),為五指山本地品種,于1985年全國(guó)農(nóng)作物品種審定委員會(huì)認(rèn)定。該品種發(fā)芽早、產(chǎn)量高,內(nèi)含物質(zhì)豐富[11]。目前有關(guān)大葉種茶的研究甚少。

鷓鴣茶(MallotusoblongifoliusMuell. Arg.),屬大戟科(Euphorbiaceae)野桐屬(Mallotus)植物,又名山苦茶,禾姑茶,毛茶,是海南的一種極具民族特色和地域特色的代茶飲料植物和藥用植物[12]。蘇冰霞等[13]發(fā)現(xiàn)鷓鴣茶多糖含量高,并優(yōu)化了多糖的最佳提取工藝。李彥軍等[14]發(fā)現(xiàn)鷓鴣茶提取物對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和酵母菌的抑菌作用顯著。李曉彤等[15]發(fā)現(xiàn)鷓鴣茶乙醇提取物的自由基清除活性較強(qiáng)。

可見,除海南大葉種茶外,其他不同茶水提物的抗氧化和抑菌活性有較少報(bào)道,但是海南4種茶之間的抗氧化活性和抑菌活性強(qiáng)弱對(duì)比目前還未見報(bào)道。且利用釀酒酵母作為模式細(xì)胞進(jìn)行抗氧化能力對(duì)比目前研究甚少。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)4種茶水提物的體外抗氧化活性、以及對(duì)野生型釀酒酵母及基因缺陷型釀酒酵母菌株的抗氧化能力及抑菌實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析,比較不同茶水提物之間的活性,為進(jìn)一步開發(fā)利用四種茶提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海南苦丁茶 海南省?？谑?產(chǎn)地五指山;海南白沙綠茶 海南省海口市,產(chǎn)地白沙縣;海南大葉種茶 海南省五指山市,產(chǎn)地五指山;海南鷓鴣茶 海南省?？谑?產(chǎn)地萬(wàn)寧;供試菌種致病細(xì)菌:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、綠膿桿菌(Pseudomonasaerugino)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus.Frankland)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院提供;供試釀酒酵母菌株:野生型WT及其同源性基因缺陷型菌株sod1Δ、ctt1Δ、gsh1Δ、gtt1Δ 由天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院提供(其中sod1Δ編碼細(xì)胞質(zhì)超氧化物歧化酶,ctt1Δ編碼過氧化氫酶,gsh1Δ編碼谷胱甘肽,gtt1Δ編碼谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶的同工酶);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) Sigma公司;2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、水解酪蛋白培養(yǎng)基(MH培養(yǎng)基) 中國(guó)索萊寶公司;沒食子酸、蘆丁、TBHQ、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)標(biāo)準(zhǔn)品 上海麥克林生化科技有限公司;其它試劑 均為市售分析純。

723N可見光分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司;U-1800紫外分光光度計(jì) HITACHI;LRH-250F恒溫生化培養(yǎng)箱 蘇州江東;HS-1300-U超凈工作臺(tái) AIRTECH; Laborota 4000 efficient旋蒸蒸發(fā)儀 HEIDOLPH;CAV213C 型電子天平 OHAUS;10、100、1000 μL型移液 Eppendorf;DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽 上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 4種茶水提物的制備 將4種茶葉粉碎,過60目篩,取50 g干粉用500 mL的蒸餾水于電磁鍋中煮沸45 min,冷卻,抽濾得到水提液;反復(fù)煮沸3次,合并水提液,于60 ℃減壓濃縮得浸膏,置于冷凍干燥機(jī)干燥,得4種茶水提物干粉,計(jì)算其提取率。

1.2.2 4種茶水提物總酚、總黃酮含量的測(cè)定 總酚含量[16]:分別將80 μL水提物樣品(1 mg/mL)和3720 μL 2%的Na2CO3接種在管中,然后加入200 μL Folin-Ciocalteau試劑。將反應(yīng)液在40 ℃下孵育,60 min后,在760 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。以沒食子酸代替樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

黃酮含量[17]:分別將0.5 mL水提物樣品加入2.5 mL去離子水和150 μL 5%亞硝酸鈉溶液中,反應(yīng)6 min后,加入300 μL 10% AlCl3,5 min后,加入1 mL 1 mol/L NaOH溶液和550 μL去離子水,混合后立即在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。以蘆丁代替樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 4種茶水提物抗氧化活性的測(cè)定

1.2.3.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用 參考文獻(xiàn)[18]的方法并稍作修改。用95%甲醇配制0.15 mmol/L DPPH溶液,在試管中加入2 mL水提物樣品(3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL)和2 mL DPPH溶液,室溫條件下孵育30 min,混勻后在517 nm測(cè)量吸光度Ai,蒸餾水代替DPPH的吸光度為Aj,蒸餾水代替樣品的吸光度為A0,以蘆丁作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品測(cè)定3次,取平均值。

1.2.3.2 對(duì)FRAP高價(jià)鐵離子的還原作用 參考文獻(xiàn)[19]的方法并稍作修改。將0.2 mL水提物樣品(50 μg/mL)加入到3.8 mL FRAP試劑(10份pH=3.6的300 mmol/L乙酸鈉溶液,1份10 mmol/L TPTZ溶液和1份20 mmol/L FeCl3溶液),混合后在37 ℃下孵育30 min,593 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度。以七水合硫酸亞鐵代替樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)樣品測(cè)定3次,取平均值。

1.2.3.3 對(duì)ABTS自由基的清除作用 參考文獻(xiàn)[17]的方法并稍作修改。通過混合10 mL 7 mmol/L ABTS溶液和10 mL的2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液,來(lái)制備ABTS自由基溶液,并在室溫下黑暗中靜置12～16 h。在使用前,將該ABTS自由基溶液用無(wú)水乙醇調(diào)節(jié)至734 nm處的吸光度為(0.7±0.02)。將100 μL水提物樣品(12.5、25、50、100、150 μg/mL)加入到3.9 mL的ABTS自由基溶液中,并使其反應(yīng)6 min,混勻于734 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度Ai,蒸餾水代替ABTS的吸光度為Aj,蒸餾水代替樣品的吸光度為A0。以TBHQ作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品測(cè)定3 次,取平均值。

1.2.3.4 對(duì)羥基自由基的清除作用 參考文獻(xiàn)[20]的方法并稍作修改。將2 mL水提物樣品(31.25、62.5、125、250、500 μg/mL)依次加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4和H2O2,混勻后靜置10 min,再加入2 mL 6 mmol/L水楊酸,混勻靜置30 min,測(cè)其510 nm波長(zhǎng)處吸光度記為Ai,用去離子水代替水楊酸的吸光度記為Aj,用去離子水代替樣品的吸光度記為A0。以TBHQ作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品測(cè)定3次,取平均值。

1.2.3.5 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用 參考文獻(xiàn)[21]的方法并稍作修改。取4.5 mL的 Tris-HCl緩沖溶液,加入3 mL去離子水混合均勻后,于25 ℃的恒溫水浴鍋中預(yù)熱20 min,再加入鄰苯三酚溶液0.4 mL,立即混勻后加入1 mL水提物樣品(62.5、125、250、500、1000 μg/mL),于25 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)4 min后,迅速加入0.1 mL 8 mol/L的鹽酸溶液終止反應(yīng)。混勻后在325 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度記為Ai。用去離子水代替鄰苯三酚的吸光度記為Ai,用Tris-HCl緩沖溶液代替樣品的吸光度記為A0。每個(gè)樣品測(cè)定3次,取平均值。

1.2.3.6 總還原能力 參考文獻(xiàn)[22]的方法并稍作修改。將1 mL水提物樣品(6.25、12.5、25、50、100 μg/mL)加入含有2.5 mL pH=6.6的磷酸鹽緩沖液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液中,混合均勻后于50 ℃水浴中保溫20 min,之后加入2.5 mL 10%三氯乙酸,混勻后以3000 r/min離心10 min,移取上清液2.5 mL并加入2.5 mL去離子水和0.5 mL 0.1% FeCl3,常溫反應(yīng)5 min后于700 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。用 BHT做陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)樣品測(cè)定3次,取平均值。

1.2.4 基于釀酒酵母評(píng)價(jià)4種茶水提物的抗氧化能力 參考Dani等[23]的方法,在酵母細(xì)胞生境中添加終濃度為2.0 mmol/L的H2O2作為額外氧化應(yīng)激誘導(dǎo)物,誘導(dǎo)酵母細(xì)胞體內(nèi)氧化還原狀態(tài)失衡。實(shí)驗(yàn)前,先驗(yàn)證細(xì)胞毒性,得到4種茶對(duì)5株酵母菌的存活率與空白對(duì)照組無(wú)明顯差異,證明4種茶對(duì)5株酵母菌均無(wú)細(xì)胞毒性后進(jìn)一步進(jìn)行抗氧化能力測(cè)定。

通過菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)4種茶水提物的抗氧化能力,以細(xì)胞存活率作為評(píng)價(jià)抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)[23]。將1 mL OD600=1的菌懸液與新鮮YPD(Yeast extract peptone dextrose medium)液體培養(yǎng)基(9 mL)充分混勻,再加入海南4種茶水提物(母液為50 mg/mL)至終濃度為100 μg/mL。振蕩混勻后,搖床培養(yǎng)2 h(28 ℃,200 r/min)。接著向含有酵母細(xì)胞的YPD液體培養(yǎng)基中加入H2O2,使其終濃度為2.0 mmol/L,渦旋振蕩均勻后,再搖床培養(yǎng)1 h(28 ℃和200 r/min)。接著用無(wú)菌水將酵母菌懸液稀釋103倍,取100 μL的菌懸液涂布均勻,然后放置于28 ℃培養(yǎng)箱中,倒置培養(yǎng),72 h后,計(jì)算細(xì)胞存活率。計(jì)算公式如下:

細(xì)胞存活率(%)=(N1/N)×100

其中,N1-經(jīng)過氧化劑或海南4種茶水提物處理后的生長(zhǎng)菌落數(shù);N-未經(jīng)過氧化劑和海南4種茶水提物處理的空白對(duì)照組的菌落總數(shù)。

1.2.5 4種茶水提物對(duì)5種致病細(xì)菌的抑菌作用 采用二倍稀釋法[24],測(cè)定4種茶水提物抑制菌株的最小抑制濃度MIC值。5種細(xì)菌濃度約為1.0×108cfu/mL(麥?zhǔn)媳葷峁?。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別取0.05 mL混合液涂布于MH固體培養(yǎng)基上,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,如無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的該藥液濃度最低者,即為對(duì)該菌株的最小抑菌濃度MIC。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 4種茶水提物中總多酚和總黃酮的含量

根據(jù)沒食子酸的濃度擬合回歸方程為Y=0.0014X+0.0016,R2=0.9967?？偠喾油ㄟ^4種茶水提物(1 mg/mL)的吸光度計(jì)算得到每克干重茶中茶水提物的沒食子酸當(dāng)量,單位為mg GAE/g DW。根據(jù)蘆丁的擬合回歸方程為Y=0.001X+0.0134,R2=0.9998?？傸S酮通過4種茶水提物(1 mg/mL)的吸光度計(jì)算出每克干重茶中茶水提物的蘆丁當(dāng)量,單位為mg RE/g DW。

如表1可知,在總多酚的測(cè)定結(jié)果中,鷓鴣茶的總多酚含量最高,為(420.05±25.65) mg GAE/g DW,苦丁茶的總多酚含量最低,為(251.48±12.30) mg GAE/g DW;而在總黃酮含量測(cè)定結(jié)果中,苦丁茶的總黃酮含量最高,為(691.60±19.47) mg RE/g DW,鷓鴣茶的總黃酮含量最低,為(217.60±7.00) RE/g DW。

表1 4種茶水提物總多酚和總黃酮的含量(n=3)Table 1 Total polyphenols contents and total flavonoids contents of four kinds of tea extracts(n=3)

2.2 4種茶水提物對(duì)DPPH自由基的清除作用

由圖1可看出,4種茶水提物和蘆丁對(duì)DPPH自由基均具有清除作用,且呈一定的量效關(guān)系。當(dāng)濃度小于25 μg/mL時(shí),4種茶的清除率增加趨勢(shì)較快;當(dāng)濃度在25～50μg/mL時(shí),各個(gè)清除率反而增加較慢,除苦丁茶抑制率為79.10%之外,另外三種茶提物的抑制率均達(dá)到80%,其中鷓鴣茶最高,為85.31%,可知鷓鴣茶對(duì)DPPH自由基的清除效果最好;同時(shí)蘆丁對(duì)DPPH自由基清除率為80.09%,與4種茶提物的清除率相比,其低于鷓鴣茶、大葉種茶及白沙綠茶,而高于苦丁茶。根據(jù)表2中五者的IC50值比較其對(duì)DPPH自由基清除率,由強(qiáng)至弱的順序?yàn)?鷓鴣茶>大葉種茶>蘆丁>白沙綠茶>苦丁茶。

表2 4種茶水提物對(duì)DPPH自由基清除作用的量效擬合方程Table 2 Dose-effect relationship simulated equations of the DPPH radical scavenging activity of four kinds of tea extracts

圖1 4種茶水提物對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effects of four kinds of tea extracts on DPPH radical

2.3 4種茶水提物對(duì)ABTS自由基的清除作用

由圖2可看出,4種茶水提物和TBHQ對(duì)ABTS自由基均具有清除作用,且濃度12.5～25 μg/mL時(shí),4種茶的清除率增加較緩慢,而隨著濃度的增加,清除率均增加較快。當(dāng)濃度達(dá)到150 μg/mL時(shí),鷓鴣茶與大葉種茶的清除率分別為94.03%、90.98%,可知鷓鴣茶對(duì)ABTS自由基的清除效果最好;而白沙綠茶和苦丁茶的清除率分別為79.53%、38.19%,可知苦丁茶對(duì)ABTS自由基的清除效果最差;同時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品TBHQ對(duì)ABTS自由基抑制率為62.00%,與4種茶提物的清除率相比,其抑制率均低于鷓鴣茶、大葉種茶和白沙綠茶。根據(jù)表3中五者的IC50值比較其對(duì)ABTS自由基清除率,由強(qiáng)至弱順序?yàn)?鷓鴣茶>大葉種茶>白沙綠茶>TBHQ>苦丁茶。

表3 4種茶水提物對(duì)ABTS自由基清除作用的量效擬合方程Table 3 Dose-effect relationship simulated equations of the ABTS radical scavenging activity of four kind of tea extracts

圖2 4種茶水提物對(duì)ABTS自由基的清除作用Fig.2 Scavenging effects of four kinds of tea extracts on ABTS radical

2.4 4種茶水提物的FRAP作用

以FeSO4質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,擬合回歸方程為Y=0.0062X+0.0327,R2=0.9986。樣品的抗氧化能力以FRAP值表示(FRAP單位=1 mmol/L FeSO4),FRAP值越大,表明由抗氧化物質(zhì)還原的Fe3+越多,即抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性越強(qiáng)。因此樣品的抗氧化能力取決于FeSO4的毫摩爾數(shù)[25]。由表4可知,4種茶水提物對(duì)高價(jià)鐵離子的還原作用由強(qiáng)至弱的順序?yàn)?鷓鴣茶>苦丁茶>大葉種茶>白沙綠茶。可知,4種茶中鷓鴣茶的高價(jià)鐵離子還原作用最強(qiáng),而苦丁茶的還原作用也較高。

表4 4種茶水提物的FRAP作用結(jié)果比較(50 μg/mL)Table 4 Comparison of FRAP effects of four kind of tea extracts(50 μg/mL)

2.5 4種茶水提物的羥基自由基清除作用

由圖3可看出,4種茶水提物和標(biāo)準(zhǔn)品TBHQ對(duì)羥基自由基均具有清除作用,且呈一定的量效關(guān)系。當(dāng)濃度31.5～125 μg/mL時(shí),TBHQ標(biāo)準(zhǔn)品的清除率最高,且隨著濃度增加增長(zhǎng)較快,而4種茶的清除率較低,且隨著濃度增加增長(zhǎng)較慢;但當(dāng)濃度在250～500 μg/mL時(shí),鷓鴣茶和大葉種茶的清除率增長(zhǎng)較快,兩者分別為88.07%、86.67%,說明高濃度的鷓鴣茶和大葉種茶對(duì)羥基自由基具有較高的清除率;其次是白沙綠茶和苦丁茶,兩者的清除率分別為76.45%和67.92%,可知苦丁茶清除率較低;同時(shí)TBHQ對(duì)羥基自由基的清除率為88.48%,與4種茶提物相比,其清除率最高,說明標(biāo)準(zhǔn)品TBHQ對(duì)羥基自由基的清除效果最好。根據(jù)表5中五者的IC50值比較其對(duì)羥基自由基清除率,由強(qiáng)至弱的順序?yàn)?TBHQ>大葉種茶>鷓鴣茶>白沙綠茶>苦丁茶。

表5 4種茶水提物對(duì)羥基自由基清除作用的量效擬合方程Table 5 Dose-effect relationship simulated equations of hydroxyl radical scavenging activity of four kind of tea extracts

圖3 4種茶水提物對(duì)羥自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effects of four kinds of tea extracts on hydroxy radical

2.6 4種茶水提物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

由圖4可看出,4種茶水提物和標(biāo)準(zhǔn)品TBHQ對(duì)超氧陰離子自由基均具有清除作用,且呈一定的量效關(guān)系。當(dāng)濃度在250 μg/mL以內(nèi),4種茶和標(biāo)準(zhǔn)品的清除率增加較緩慢;但當(dāng)濃度為500 μg/mL以上時(shí),各個(gè)清除率均大幅度增加,且清除率趨于接近。鷓鴣茶和大葉種茶兩者在1000 μg/mL時(shí)的清除率分別為84.86%和78.32%,可知鷓鴣茶對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果最好;其次是白沙綠茶和苦丁茶,兩者的清除率分別為77.31%和73.27%,可知苦丁茶對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果最差;同時(shí)4種茶提物與標(biāo)準(zhǔn)品TBHQ相比,TBHQ的清除率最低,為72.60%,說明TBHQ對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果均不如以上4種茶提物。根據(jù)表6中五者的IC50值比較其對(duì)超氧陰離子自由基清除率,由強(qiáng)至弱的順序?yàn)?大葉種茶>鷓鴣茶>白沙綠茶>苦丁茶>TBHQ。

圖4 4種茶水提物對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.4 Scavenging effects of four kinds of tea extracts on superoxide anion radical

表6 4種茶水提物對(duì)超氧陰離子自由基清除作用的量效擬合方程Table 6 Dose-effect relationship simulated equations of superoxide anion radical scavenging activity of four kinds of tea extracts

2.7 4種茶水提物的總抗氧化能力

由圖5看出,4種茶水提物和標(biāo)準(zhǔn)品BHT的總還原能力通過吸光度值進(jìn)行比較,可知五者均有總還原能力,且總還原能力隨著濃度的增加而增加,呈一定的量效關(guān)系。大葉種茶在5個(gè)濃度中均比另外三種茶水提物的吸光度值高,說明大葉種茶的總還原能力最強(qiáng),其次是鷓鴣茶的總還原能力較強(qiáng),白沙綠茶和苦丁茶的總還原能力較弱;同時(shí)4種茶水提物與標(biāo)準(zhǔn)品BHT相比,BHT的總還原能力較高,但低于大葉種茶;而鷓鴣茶在前4個(gè)濃度中其總還原能力都高于標(biāo)準(zhǔn)品BHT,但當(dāng)濃度升為100 μg/mL時(shí),總還原能力低于標(biāo)準(zhǔn)品BHT。根據(jù)表7中五者的IC50值比較其總抗氧化能力,由強(qiáng)至弱的順序?yàn)?大葉種茶>BHT>鷓鴣茶>白沙綠茶>苦丁茶。

表7 4種茶水提物總抗氧化能力的量效擬合方程Table 7 Dose-effect relationship simulated equations of total antioxidant capacity of four kinds of tea extracts

圖5 4種茶水提物的總抗氧化能力Fig.5 Total antioxidant capacity offour kinds of tea extracts 注:*代表同濃度組之間各處理與BHT處理相比具有顯著差異(p<0.05)。

2.8 基于釀酒酵母評(píng)價(jià)4種茶水提物的抗氧化能力

基于釀酒酵母評(píng)價(jià)4種茶水提物的抗氧化能力結(jié)果如圖6所示,空白對(duì)照組各株酵母菌在受到H2O2氧化應(yīng)激后,細(xì)胞存活率下降明顯,尤其是基因缺陷型酵母ctt1Δ受到H2O2氧化應(yīng)激后存活率僅剩2.87%。當(dāng)分別加入4種茶水提物之后,各株酵母菌的存活率均明顯有所提高,其中基因缺陷型菌株gsh1Δ在加入苦丁茶時(shí)存活率最高,其存活率為43.61%,提高了30.21%;其次為基因缺型菌株sod1Δ加入白沙綠茶后存活率最高,菌株sod1Δ存活率提高了20.59%;對(duì)于基因缺陷型菌株gtt1Δ加入苦丁茶后存活率最高,且提高了16.43%;最敏感的基因缺陷型酵母菌株ctt1Δ,在加入鷓鴣茶后存活率最高,且提高了15.71%;而野生型菌株WT,分別加入苦丁茶、白沙綠茶、大葉種茶和鷓鴣茶后，發(fā)現(xiàn)這4種茶對(duì)菌株WT的存活率作用并不理想,其中鷓鴣茶最高僅提高了6.49%。以上結(jié)果可說明,4種茶對(duì)5株釀酒酵母的抗氧化能力具有一定的選擇性,其中苦丁茶對(duì)于基因缺陷型菌株gsh1Δ的抗氧化活性最強(qiáng)。4種茶對(duì)野生型菌株WT的抗氧化活性較差,其原因可能與野生型菌株WT本身的抗氧化防御機(jī)制相關(guān),其防御機(jī)制完善，因而對(duì)于外源物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生抵抗效果，使得茶提物成分未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)起作用;而4株基因缺陷型菌株，通過加入茶提取物之后，其活性成分有助于補(bǔ)充基因缺陷型菌株的防御功能;且抗氧化能力較差的茶提取物更有可能與該菌株基因缺陷表達(dá)相關(guān)[26]。

圖6 H2O2脅迫下4種茶水提物對(duì)釀酒酵母的抗氧化能力Fig.6 Antioxidant capacity of four kind of tea extracts under H2O2 stress to Saccharomyces cerevisiae注:*代表同菌種組之間各處理與H2O2+水處理相比有顯著差異(p<0.05),* *代表極顯著(p<0.01)。

2.9 4種茶水提物對(duì)5種致病菌的抑菌作用

由表8可知,4種茶對(duì)致病菌有一定的抑制活性,但不如陽(yáng)性對(duì)照鏈霉素抑菌效果強(qiáng)?？喽〔鑼?duì)綠膿桿菌和枯草芽孢桿菌沒有明顯抑制效果,但是對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌效果,其MIC為3.13 mg/mL;其次是蠟樣芽孢桿菌,其MIC為6.25 mg/mL;而大腸桿菌有較低的抑菌效果,其MIC為12.50 mg/mL。白沙綠茶對(duì)綠膿桿菌、蠟樣芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌均沒有明顯抑制效果,同時(shí)對(duì)大腸桿菌的抑制效果也很低,而對(duì)枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑制效果,其MIC為6.25 mg/mL。大葉種茶對(duì)枯草芽孢桿菌也沒有明顯抑菌效果,而對(duì)金黃色葡萄球菌具有很強(qiáng)的抑菌效果,其MIC為1.56 mg/mL;其次是對(duì)蠟樣芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑菌效果,其MIC為6.25 mg/mL;而對(duì)大腸桿菌和綠膿桿菌效果較低,其MIC均為12.50 mg/mL。鷓鴣茶對(duì)金黃色葡萄球菌也具有較強(qiáng)的抑制活性,MIC為3.13 mg/mL;且對(duì)另外4種致病菌的MIC均為6.25 mg/mL。由此可知,4種茶對(duì)5種致病菌的抑制具有一定的選擇性,且大葉種茶對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng),鷓鴣茶的抑菌活性較為廣譜。

表8 4種茶水提物對(duì)5種致病菌的生長(zhǎng)情況Table 8 Growth of four kind of tea extracts against five kind of pathogenic bacteria

3 討論

通過對(duì)海南4種茶水提物的總多酚和總黃酮含量測(cè)定,由結(jié)果可知,鷓鴣茶的總多酚最多,為(420.05±25.65 mg) GAE/g DW,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于李曉彤等[15]的鷓鴣茶水提物研究結(jié)果((25.085±0.196) mg CE/g DW),其主要原因?yàn)榕c方法不同以及所選的標(biāo)準(zhǔn)品不同,同時(shí)樣品提取方法也不相同,其有效成分含量也有一定的差異。而4種茶中苦丁茶的總黃酮含量最多,為(691.60±19.47) mg RE/g DW。同時(shí)通過4種茶水提物對(duì)6種體外抗氧化能力的測(cè)定,綜合測(cè)定結(jié)果得知鷓鴣茶的體外抗氧化能力最強(qiáng),說明體外抗氧化活性與總多酚具有一定的相關(guān)性,通過與Kwon等[27]報(bào)道相比,自由基清除能力與酚含量增加成正相關(guān)關(guān)系,其結(jié)果是一致的。

通過對(duì)5株釀酒酵母的抗氧化活性測(cè)定,得知4種茶對(duì)5株釀酒酵母的抗氧化能力具有一定的選擇性,其中苦丁茶對(duì)于基因缺陷型菌株gsh1Δ的抗氧化能力最強(qiáng),而4種茶中苦丁茶的黃酮含量最高,因此可進(jìn)一步猜測(cè)基因缺陷型菌株gsh1Δ的抗氧化機(jī)制是否與黃酮相關(guān)。

通過對(duì)5種致病菌的活性測(cè)試,得到海南大葉種茶對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑制效果最佳,其MIC值為1.56 mg/mL,可為食品防腐劑提供理論依據(jù);同時(shí)鷓鴣茶對(duì)大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、綠膿桿菌以及枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用,其MIC值均為6.25 mg/mL,表明鷓鴣茶的抑菌活性較為廣譜。以上對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與呂平等[28]4種茶不同提取物的體外抑菌作用研究結(jié)果相近。

4 結(jié)論

通過對(duì)海南苦丁茶、白沙綠茶、大葉種茶及鷓鴣茶的水提物體外抗氧化活性和抑菌活性比較發(fā)現(xiàn),4種茶提物中,鷓鴣茶的總酚含量((420.05±25.65) mg GAE/g DW)最高;苦丁茶的黃酮含量((691.60±19.47) mg RE/g DW)最高;鷓鴣茶對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基及超氧陰離子自由基清除作用以及對(duì)高價(jià)鐵離子還原能力最強(qiáng),而大葉種茶的總還原能力最強(qiáng)。4種茶水提物分別對(duì)H2O2氧化應(yīng)激脅迫下的5株釀酒酵母有一定的抗氧化能力,其中,經(jīng)過苦丁茶水提物處理后基因缺陷型菌株gsh1Δ的存活率提高了30.21%,其抗氧化能力最強(qiáng);4種茶水提物分別對(duì)5種致病細(xì)菌有一定的抑制作用,其中大葉種茶對(duì)于金黃色葡萄球菌的抑制效果最好,其MIC值為1.56 mg/mL。鷓鴣茶對(duì)大腸桿菌、蠟樣芽孢桿菌、綠膿桿菌以及枯草芽孢桿菌均有抑制作用,其MIC值均為6.25 mg/mL。以上的研究結(jié)果表明,海南4種茶水提物具有不同的抗氧化活性及抑菌活性,其活性與總酚含量存在一定相關(guān),鷓鴣茶總酚含量較高,抗氧化活性和抑菌活性較好。該結(jié)果能否有廣泛的適應(yīng)性還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。