楊玉平，涂林，金嬋，覃娟，李文博，唐婧苗，謝柏艷

（武漢藥品醫(yī)療器械檢驗所，湖北武漢430075）

農(nóng)藥廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，它在防治病蟲害等方面發(fā)揮著顯著的作用，但在實際操作過程中，由于農(nóng)藥產(chǎn)品的質(zhì)量和管理力度問題，導(dǎo)致不科學(xué)、不合理使用農(nóng)藥的情況時有發(fā)生[1]，隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的不斷提高，人們越來越重視食用農(nóng)產(chǎn)品的安全衛(wèi)生，因此蔬菜樣品中農(nóng)藥殘留問題也越來越引起人們的關(guān)注。農(nóng)藥殘留的監(jiān)督和檢測體系是加強農(nóng)藥管理的重要環(huán)節(jié)，因此建立一個準(zhǔn)確、快速、方便可行的檢測方法尤為重要[2]。

農(nóng)藥多殘留分析方法一般采用氣相色譜法（gas chromatography，GC）[3]、高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[4-5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）[6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）[7-8]等。但是由于需要檢測的農(nóng)藥種類和組分繁多，以及樣品中多殘留共存的現(xiàn)象突出，使得單一的檢測方法很難滿足所有多殘留樣品的檢測要求，有效應(yīng)用聯(lián)用技術(shù)和儀器，是解決以上問題的根本方法[9]。而且，歐盟委員會2002/657/EC決議中規(guī)定[10]：對于禁用農(nóng)藥的陽性結(jié)果必須經(jīng)過質(zhì)譜確認(rèn)，以保證定性、定量檢測的可靠性，降低假陽性率。LC-MS/MS能夠區(qū)分或消除復(fù)雜基質(zhì)中的其他物質(zhì)的干擾，靈敏度高，分析速度快，所以被認(rèn)為是分析復(fù)雜基質(zhì)中農(nóng)藥殘留最準(zhǔn)確可靠的技術(shù)[11-13]。

本文旨在研究建立一種高效、適用性強的HPLC/MS/MS檢測方法，同時檢測蔬菜中不同種類、性質(zhì)差異較大的28種農(nóng)藥，研究方法的加標(biāo)回收率、精密度、檢出限、線性范圍、基質(zhì)適用性等。結(jié)合參考文獻[14-17]及國家食藥監(jiān)總局定期公布的食用農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)督抽查結(jié)果分析，有針對性的選取了克百威、氧化樂果、多菌靈、啶蟲脒等28種毒性較強、檢出率較高的農(nóng)藥并且用建立的分析方法對來自不同集貿(mào)市場的500批蔬菜樣品進行了定量定性分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔬菜樣品來自各個集貿(mào)市場，蔬菜品種涉及青椒、白菜、西紅柿、黃瓜、花椰菜、芹菜、豆角、蔥、蒜、韭菜、土豆等常見品種。

甲醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷均為液相色譜級：Fisher chemical；甲酸、乙酸銨均為分析純：國藥集團；氯化鈉（分析純）：國藥集團，用前在140℃烘烤4 h；無水硫酸鈉（分析純）：國藥集團，用前在650℃灼燒1 h，貯于干燥器中，冷卻后備用；NH2固相萃取柱（500 mg/6 mL）：天津博納艾杰爾公司；異丙威、甲萘威、抗蚜威、多菌靈、殘殺威、甲拌磷、毒死蜱、甲胺磷、嘧霉胺、仲丁威、克百威、樂果、滅線磷、乙拌磷、倍硫磷、乙硫磷、馬拉硫磷、丙溴磷、敵敵畏、涕滅威砜、速滅威、殺螟硫磷、腐霉利、亞胺硫磷、氧樂果、啶蟲脒：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，質(zhì)量濃度為100 μg/mL；阿維菌素、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽：農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，阿維菌素質(zhì)量濃度為100 μg/mL，甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽為固體對照。

1.2 儀器與設(shè)備

API4000高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國ABSciex公司；T25高速組織勻漿儀：德國IKA；HY-5調(diào)速多用振蕩器：常州國華電器有限公司；L530離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；ASE-12固相萃取儀：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；N-EVAP112氮吹儀：美國OA。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取與凈化

蔬菜樣品取可食部分切碎、混勻。稱取混勻的樣品20 g（精確至0.01 g）于具塞錐形瓶中，加40 mL乙腈，用高速組織勻漿機在15 000 r/min勻漿提取1 min，加入約5 g氯化鈉，再勻漿提取1 min，再3 000 r/min離心5 min，吸取上層溶液過無水硫酸鈉后，精密量取10 mL于45℃水浴減壓濃縮近干；用1 mL淋洗液（丙酮∶二氯甲烷=1∶1）洗滌平底燒瓶3次，并分別把洗滌液轉(zhuǎn)移到活化好的NH2柱上，當(dāng)液面到達固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）柱篩板表面后，再加入淋洗液22 mL，收集全部淋洗液，于45℃水浴減壓濃縮近干，氮氣吹干，用10 mL甲醇準(zhǔn)確定容,用0.22 μm濾膜濾過，上清液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

28種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇配制成10 μg/mL的單標(biāo)儲備液，置于-18℃冰箱中保存。使用時用甲醇稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液：用空白樣品基質(zhì)提取液將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制啶蟲脒為 7.5、15、30、45、60、75、150、225、300 ng/mL，其他農(nóng)藥為 5、10、20、30、40、60、100、15、200 ng/mL系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液，基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液需現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.3 色譜與質(zhì)譜條件

1.3.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Agilent C18（150 mm×2.1 mm，5 μm）；流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；流動相：A為0.005 mol/L乙酸銨+0.05%甲酸水溶液；B為乙腈；梯度洗脫程序見表1。

表1 28種農(nóng)藥的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures for 28 pesticides

1.3.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）；掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；噴霧電壓：5 500 V；去溶劑溫度：500 ℃；氣簾氣：275.8 kPa；霧化氣：344.75 kPa；輔助加熱氣：344.75 kPa；定性離子對、定量離子對、去簇電壓及碰撞氣能量見表2。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取條件的優(yōu)化

蔬菜樣品基質(zhì)差異較大，而且色素含量較多，選取合適的提取溶劑，有利于后續(xù)凈化過程的操作。本試驗對比了乙酸乙酯、丙酮、乙腈3種提取溶劑，以乙酸乙酯提取，部分農(nóng)藥回收率較低；以丙酮和乙腈提取時均能得到較好的回收率，但丙酮提取液水分較多，溶液顏色較深，對后續(xù)凈化過程的要求較高。而乙腈對大多數(shù)農(nóng)藥有較好的溶解性，提取液在加入NaCl充分振搖后離心可以與水相充分分離，而且對環(huán)境污染和人體危害較小，因此選取乙腈作為提取溶劑。

表2 28種農(nóng)藥的保留時間和質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Retention times and mass spectrometric analysis parameters for 28 pesticides

2.2 凈化條件的優(yōu)化

SPE是一種經(jīng)典的凈化方式，具有節(jié)省溶劑、經(jīng)濟、高效等特點，因此本文選取SPE作為凈化方法。固相萃取柱常用的填料有石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）、NH2和 C18等。GCB 對色素有強烈的吸附效果，NH2具有極性固定相和弱陰離子交換劑，可通過弱陰離子交換或極性吸附達到保留作用，因此具有雙重作用，C18多用于去除脂肪等非極性雜質(zhì)[18]。研究表明，GCB在吸附色素的同時，會導(dǎo)致含有平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥如多菌靈、氟蟲腈等回收率急劇降低[19-20]，因此，參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 20769-2008《水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中前處理方法采用NH2凈化柱[21]，含有平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥回收率滿足國家標(biāo)準(zhǔn)要求，因此本試驗選取NH2固相萃取柱做為凈化柱。

2.3 色譜條件優(yōu)化

液相流動相的組成不僅會影響到目標(biāo)化合物的保留時間和峰形，還會影響到離子化效率，從而影響檢測靈敏度。本方法比較了乙腈-水（V+V）、乙腈-0.1%甲酸水溶液（V+V）、乙腈-0.005 mol/L乙酸銨+0.05%甲酸水溶液（V+V）3種流動相，結(jié)果表明在酸性條件下不僅可以提高目標(biāo)物的離子化程度，還可以改善峰形，因此選取加入甲酸的流動相。進一步比較乙腈-0.1%甲酸水溶液（V+V）、乙腈-0.005 mol/L乙酸銨+0.05%甲酸水溶液（V+V）這兩種流動相，結(jié)果表明后者為流動相時，各目標(biāo)物峰型較好，響應(yīng)較高，綜合考慮后決定選取乙腈-0.005 mol/L乙酸銨+0.05%甲酸水溶液（V+V）為流動相。通過不斷摸索色譜柱梯度洗脫程序，使得28種農(nóng)藥在30分鐘內(nèi)得到很好的分離。圖1為空白基質(zhì)樣品中添加20 μg/kg農(nóng)藥的提取離子色譜圖。

圖1 空白樣品基質(zhì)中添加20 μg/kg農(nóng)藥的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of a blank spiked with28 pesticides at 20 μg/kg

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

首先在電噴霧離子源正離子模式下，先對28種農(nóng)藥的單標(biāo)溶液進行全掃描，獲得穩(wěn)定的母離子，選取[M+H]母離子進行二級碰撞，每個化合物至少選取兩對離子進行測定，一對離子作為定量離子，一對離子作為定性離子[19]。本研究對28種目標(biāo)農(nóng)藥的分析條件進行了優(yōu)化，包括選取合適的特征離子對和優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量等參數(shù)，最終確立了1.3.3.2的質(zhì)譜條件。

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1 方法的線性范圍和檢出限、定量限

由于食品樣本基質(zhì)背景復(fù)雜，在前處理凈化后并不能完全去除雜質(zhì)的干擾，樣品共流出物的存在對目標(biāo)化合物的離子化效率產(chǎn)生很大的影響，基質(zhì)效應(yīng)成為影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度的關(guān)鍵因素[22]，消除和補償分析中帶來的基質(zhì)效應(yīng)，常采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液[23-25]。本研究采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法進行校準(zhǔn)定量。

配制好的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化好的色譜和質(zhì)譜條件進行測定，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度X（ng/mL）為橫坐標(biāo)，以定量離子對的峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10），確定方法的檢出限和定量限。28種農(nóng)藥的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和定量限見表3。

表3 28種農(nóng)藥的線性范圍、回歸方程、定量限、加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 The linear ranges，regression equations，limits of quantitation，recoveries and relative stardard deviations of 28 pesticides

由表3可見，本方法檢出限低、靈敏度高、相關(guān)性好，適用于28種農(nóng)藥的定量分析。

2.5.2 方法的回收率和精密度

本方法采用陰性蔬菜樣品的加標(biāo)試驗來進行準(zhǔn)確度和精密度評價，啶蟲脒在 30、60、150 μg/kg 3 個添加水平，其他農(nóng)藥在 20、40、100 μg/kg 3 個添加水平，每個水平重復(fù)6次，測得平均回收率為63.9%～120.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～9.8%，結(jié)果見表3。從表3可以看出，本方法的準(zhǔn)確度和精密度均能滿足目標(biāo)化合物的實驗室監(jiān)測要求。

2.5.3 實際樣品的檢測

采用本文建立的方法對來自各個不同集貿(mào)市場的約50批樣品進行檢測，品種涉及青椒、白菜、西紅柿、黃瓜、花椰菜、芹菜、豆角，大蔥、大蒜、土豆等常見品種。對50批樣品分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多菌靈、啶蟲脒的檢出率較高，檢出率約5%，根據(jù)GB 2763-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定，多菌靈、啶蟲脒的檢出量均在農(nóng)藥最大殘留量的允許范圍內(nèi)，符合國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，其他農(nóng)藥的檢出率較低。對檢測出的農(nóng)藥根據(jù)歐盟委員會2002/657/EC決議進行了定性確證，結(jié)果表明本方法適合同時分析不同蔬菜品種中28種農(nóng)藥殘留，基質(zhì)干擾較小，能夠滿足實驗室日常檢測任務(wù)需要。

3 結(jié)論

通過對方法的提取溶劑、凈化條件、色譜、質(zhì)譜等條件的優(yōu)化，建立了一種采用乙腈提取，SPE凈化，同時檢測不同蔬菜品種中28種農(nóng)藥殘留的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，該方法具有應(yīng)用范圍廣、靈敏度高等特點，實現(xiàn)了28種農(nóng)藥殘留的同時快速檢測，檢出限、定量限均符合國家標(biāo)準(zhǔn)，重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性優(yōu)，基質(zhì)適用性好，可應(yīng)用于實驗室的日常檢測工作。