劉春宇，朱振元，孫會(huì)輕，王淮旭，張立娟

（食品營(yíng)養(yǎng)與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

蛹蟲草（Cordyceps militaris），又名北冬蟲夏草，與冬蟲夏草同屬異種是一種名貴的中草藥[1]。蛹蟲草含有蟲草多糖、蟲草素、核苷類、甾醇類等營(yíng)養(yǎng)成分和人體必需的氨基酸、維生素和過氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等多種生物活性物質(zhì)[2]。多糖是蛹蟲草提取物的重要活性成分之一，研究表明，蛹蟲草多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用、抗癌作用、抗氧化作用、降血糖功能、對(duì)肝炎的治療作用以及對(duì)酒精所致肝損傷的保護(hù)作用等生物活性功能[3-5]。目前蛹蟲草產(chǎn)品開發(fā)主要集中在蟲草酒制品、膠囊保健品、蛹蟲草保健醬油等方面，但關(guān)于便攜式功能食品尤其是速溶性固體飲料功能食品的開發(fā)較少。因此本文用蛹蟲草提取物復(fù)配山楂提取物制備固體飲料，不僅提高固體飲料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)開拓了蛹蟲草新產(chǎn)品加工新途徑，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草子實(shí)體：天津東方中濱農(nóng)業(yè)科技有限公司；山楂：市售一級(jí)；木糖醇購：安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司；檸檬酸：北京北方霞光食品添加劑有限公司。以上原料均為食品級(jí)。

1.2 材料與設(shè)備

ESJ205-4電子天平：沈陽龍騰電子標(biāo)量?jī)x器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機(jī)：美國(guó)Thermo公司；LD4-40型低速大容量離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；SP-2102UV型紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司。

1.3 蛹蟲草提取物的制備

1.3.1 工藝流程

蛹蟲草子實(shí)體→粉碎、過篩→提取→離心→濃縮→醇沉→離心→凍干→蛹蟲草提取物

1.3.2 試驗(yàn)步驟

將干燥的蛹蟲草子實(shí)體用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，精確稱取一定質(zhì)量的蛹蟲草粉末，按固液比1∶10（g/mL）比例加入蒸餾水，在80℃水浴條件下提取2 h，在4 000 r/mim條件下離心10 min，收集上清液，固體沉淀重復(fù)提取2次，合并上清液；將蛹蟲草提取液進(jìn)行旋蒸、濃縮；以1∶4（濃縮液∶無水乙醇，體積比）的比例向濃縮液中加入無水乙醇，對(duì)濃縮液進(jìn)行醇沉處理；醇沉24 h后，將醇沉體系在4 000 r/min條件下離心10 min，棄去上清液，收集所得沉淀，沉淀用真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干，得到淡黃色無味粉末，為蛹蟲草提取物，記錄蛹蟲草提取物的質(zhì)量計(jì)算其得率，并用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 山楂提取物的制備

1.4.1 工藝流程

山楂→清洗→烘干→去核→粉碎、過篩→提取→離心→濃縮→醇沉→離心→凍干→山楂提取物

1.4.2 試驗(yàn)步驟

將山楂清洗、去核后烘干，用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，精確稱取一定質(zhì)量的山楂粉末，參考1.3.2步驟對(duì)山楂粉末進(jìn)行提取，凍干后得到淺黃色粉末，為山楂提取物，記錄山楂提取物的質(zhì)量計(jì)算其得率，并用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 蛹蟲草提取物、山楂提取物有效成分含量的測(cè)定

分別精確稱取蛹蟲草提取物、山楂提取物5 mg，加入少量蒸餾水溶解，定容至5 mL，得到濃度為1 mg/mL的蛹蟲草提取物溶液和山楂提取物溶液，分別對(duì)其總糖、還原糖、蛋白質(zhì)及黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。

1.5.1 總糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[6]分別測(cè)定蛹蟲草提取物、山楂提取物中可溶性總糖含量。

1.5.2 還原糖含量的測(cè)定

采用 3，5-二硝基水楊酸 （3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[7]分別測(cè)定蛹蟲草提取物、山楂提取物中還原糖含量。

1.5.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)（G-250）法[8]分別測(cè)定蛹蟲草提取物、山楂提取物中可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.5.4 黃酮含量的測(cè)定

采用蘆丁比色法[9]分別測(cè)定蛹蟲草提取物、山楂提取物中黃酮含量。

1.6 蛹蟲草山楂固體飲料的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

參照GB/T 17321-2012《感官分析方法二-三點(diǎn)檢驗(yàn)》[10]和GB/T 21172-2007《感官分析食品顏色評(píng)價(jià)的總則和檢驗(yàn)方法》[11]中感官分析標(biāo)準(zhǔn)，制定《蛹蟲草、山楂提取物固體飲料的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》。將沖泡好的固體飲料，由10名（5男5女）感官評(píng)價(jià)人員對(duì)其進(jìn)行感官評(píng)分，每次評(píng)分前用溫開水漱口。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示，按照如下標(biāo)準(zhǔn)，分為4個(gè)等級(jí)，分別對(duì)其評(píng)分。綜合感官評(píng)價(jià)分值＝20%×外觀形態(tài)評(píng)分＋20%×色澤評(píng)分＋20%×風(fēng)味評(píng)分＋40%×口感評(píng)分[12]。

表1 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The evaluation criteria of Cordyceps militaris extract and hawthorn extract solid beverages

1.7 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料單因素試驗(yàn)

1.7.1 蛹蟲草提取物添加量對(duì)飲料感官評(píng)分的影響

蛹蟲草提取物添加量分別為 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 g，山楂提取物添加量為2.0 g，檸檬酸添加量為0.08 g，木糖醇添加量為2.0 g，將復(fù)配好的樣品溶于100 mL熱水中，對(duì)飲料進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。以感官評(píng)分為指標(biāo)，確定蛹蟲草提取物的最適添加量。

1.7.2 山楂提取物添加量對(duì)飲料感官評(píng)分的影響

山楂提取物添加量分別為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g，蛹蟲草提取物添加量為0.5 g，檸檬酸添加量為0.08 g，木糖醇添加量為2.0 g。參照1.7.1步驟，確定山楂提取物的最適添加量。

1.7.3 木糖醇添加量對(duì)飲料感官評(píng)分的影響

木糖醇添加量分別為 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g，蛹蟲草提取物添加量為0.5 g，山楂提取物添加量為2.0 g，檸檬酸添加量為0.08 g。參照1.7.1步驟，確定木糖醇的最適添加量。

1.7.4 檸檬酸添加量對(duì)飲料感官評(píng)分的影響

檸檬酸添加量分別為 0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 g，蛹蟲草提取物添加量為0.5 g，山楂提取物添加量為2.0 g，木糖醇添加量為2.0 g。參照1.7.1步驟，確定檸檬酸的最適添加量。

1.8 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為使蛹蟲草、山楂提取物固體飲料口感達(dá)到最佳，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，得出蛹蟲草、山楂提取物固體飲料的最佳配方，正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 2 Design of orthogonal experiment factors and levels

1.9 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料理化性質(zhì)的測(cè)定

1.9.1 固體飲料粉潤(rùn)濕性的測(cè)定

稱取0.500 g樣品均勻平鋪于200 mL蒸餾水水面上，記錄樣品從加入至完全沉降所需要的時(shí)間（s）。

1.9.2 固體飲料分散性的測(cè)定

稱取5.000 g樣品加入50 mL蒸餾水，在恒溫磁力攪拌器上攪拌，記錄從攪拌開始到粉塊全部分散所需要的時(shí)間（s）。

1.9.3 固體飲料粉溶解度的測(cè)定

精確稱量樣品5.000 g，置于50 mL小燒杯中，加入蒸餾水30 mL，在25℃條件下用磁力攪拌器攪拌30 min，使蛹蟲草、山楂提取物固體飲料充分溶解。將溶液轉(zhuǎn)移至容量瓶中，并用蒸餾水定容至50 mL，充分搖勻。取15 mL溶解液，放入離心管中，3 000 r/mim離心10 min，取上清液，將其全部轉(zhuǎn)移至干燥的稱量皿中，放入105℃干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定[13]。

式中：X為樣品溶解度，g/100 g；M為樣品質(zhì)量，g；m1為稱量皿質(zhì)量，g；m2為稱量皿和不溶物干燥后質(zhì)量，g；B為樣品水分含量，%。

1.10 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料感官、理化和微生物指標(biāo)檢驗(yàn)

水分含量測(cè)定，參照GB 5009.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》中的直接干燥法；鉛（以Pb計(jì)）測(cè)定，參照GB 5009.12-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉛的測(cè)定》；總砷（以As計(jì)）測(cè)定，參照GB 5009.11-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總砷及無機(jī)砷的測(cè)定》；菌落總數(shù)測(cè)定，參照GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》；大腸菌群測(cè)定，參照GB 4789.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群計(jì)數(shù)》；霉菌和酵母菌測(cè)定，參照GB 4789.15-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)》；致病菌限量測(cè)定，參照GB 29921-2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中致病菌限量》。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草提取物、山楂提取物得率

蛹蟲草子實(shí)體粉末與山楂粉末經(jīng)水提醇沉、真空冷凍干燥后得到蛹蟲草提取物及山楂提取物。經(jīng)計(jì)算，蛹蟲草提取物及山楂提取物的得率分別為6.72%和23.79%。

2.2 蛹蟲草提取物、山楂提取物有效成分含量

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

參照1.5中方法，測(cè)定總糖含量和還原糖含量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為y=0.010 1x+0.022 9（R2=0.999 2）和 y=0.001 1x-0.031 3（R2=0.999 2）；測(cè)定蛋白質(zhì)含量的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲回歸方程為y=0.005 7x+0.006 5（R2=0.999 1）；測(cè)定黃酮含量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=2.107x-0.083 7（R2=0.999 0）。綜上所述，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程具有良好的線性關(guān)系，可用于指標(biāo)的測(cè)定。

2.2.2 有效成分含量

蛹蟲草提取物和山楂提取物中有效成分測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

表3 蛹蟲草提取物、山楂提取物有效成分含量Table 3 The active ingredient contents of Cordyceps militaris extract and hawthorn extract%

由表3可得，蛹蟲草提取物和山楂提取物的主要成分均為糖類物質(zhì)，其中多糖類物質(zhì)的含量分別為37.63%和35.70%；據(jù)報(bào)道，山楂多糖具有抗氧化[14]、抗疲勞[15]、降血壓[16]、降血脂[17]等作用；蛹蟲草多糖具有抗氧化、降血糖、保肝、抗腫瘤等生物活性。其次為蛋白類物質(zhì)；除此之外還含有少量黃酮類物質(zhì)。

2.3 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料單因素試驗(yàn)

2.3.1 蛹蟲草提取物添加量對(duì)飲料感官評(píng)分的影響

蛹蟲草提取物添加量對(duì)飲料感官評(píng)分的影響如圖1所示。

圖1 蛹蟲草提取物添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分的影響Fig.1 Influence of Adding Amount of Extract from Cordyceps militaris on Sensory Score

由圖1可知，飲料的感官評(píng)分隨蛹蟲草提取物添加量的增加呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，在蛹蟲草提取物添加量為0.5 g時(shí)達(dá)到最大（93.9±1.9），且與其他組具有極顯著差異。因此，蛹蟲草提取物的最適添加量為0.5 g。

2.3.2 山楂提取物添加量對(duì)飲料感官評(píng)分的影響

山楂提取物添加量對(duì)飲料感官評(píng)分的影響如圖2所示。

由圖2可知，飲料的感官評(píng)分隨山楂提取物添加量的增加呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，在山楂提取物添加量為2.0 g時(shí)達(dá)到最大（91.9±1.5），且與其他組具有極顯著差異。山楂提取物溶于水后味道偏酸，會(huì)對(duì)飲料的味道產(chǎn)生顯著影響。因此，山楂提取物的最適添加量為2.0 g。

圖2 山楂提取物添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分的影響Fig.2 Influence of adding amount of extract from hawthorn on sensory score

2.3.3 木糖醇添加量對(duì)飲料感官評(píng)分的影響

木糖醇添加量對(duì)飲料感官評(píng)分的影響如圖3所示。

圖3 木糖醇添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分的影響Fig.3 Influence of adding amount of xylitol on sensory score

由圖3可知，在木糖醇添加量為1.0 g～2.0 g范圍內(nèi)，飲料的感官評(píng)分呈上升的趨勢(shì)；在木糖醇添加量為2.0 g和2.5 g時(shí)，感官評(píng)分沒有差異；在木糖醇添加量為3.0 g時(shí)感官評(píng)分顯著下降。木糖醇可以增加飲料的甜度，但過量的木糖醇會(huì)使飲料甜度過大，影響產(chǎn)品的口味。因此，木糖醇的最適添加量為2.0 g。

2.3.4 檸檬酸添加量對(duì)飲料感官評(píng)分的影響

檸檬酸添加量對(duì)飲料感官評(píng)分的影響如圖4所示。

由圖4可知，當(dāng)檸檬酸添加量在0.06 g和0.08 g時(shí)，飲料的感官評(píng)分沒有顯著差異，但極顯著優(yōu)于其他組。適量的檸檬酸可以調(diào)節(jié)產(chǎn)品的酸味，但過量添加會(huì)使產(chǎn)品的酸度過大，影響其口感。因此，檸檬酸的最適添加量為0.06 g。

2.4 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料正交試驗(yàn)

圖4 檸檬酸添加量對(duì)產(chǎn)品感官評(píng)分的影響Fig.4 Influence of adding amount of citric acid on sensory score

由單因素試驗(yàn)結(jié)果得出，蛹蟲草提取物添加量、山楂提取物添加量、木糖醇添加量、檸檬酸添加量均對(duì)飲料的感官評(píng)分有顯著影響，因此在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，對(duì)蛹蟲草提取物添加量、山楂提取物添加量、木糖醇添加量、檸檬酸添加量四因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，優(yōu)化蛹蟲草、山楂提取物固體飲料的最佳配方。利用SPSS18.0對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析結(jié)果和方差分析結(jié)果分別如表4和表5所示。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 Results and analysis of orthogonal experimental

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experimental

由表4和表5可以看出，4個(gè)因素對(duì)飲料的感官評(píng)分都有顯著的影響，主次順序?yàn)锳（蛹蟲草提取物添加量）＞D（檸檬酸添加量）＞B（山楂提取物添加量）＞C（木糖醇添加量），最小的是木糖醇的添加量。得到飲料的最佳配比為A2B2C2D1，即蛹蟲草提取物0.5 g、山楂提取物2.0 g、木糖醇2.0 g、檸檬酸0.05 g。按以上條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得出感官評(píng)分的平均值為95.42，高于表4中的試驗(yàn)結(jié)果，因此，蛹蟲草、山楂提取物固體飲料的最佳配比為：蛹蟲草提取物0.5 g、山楂提取物2.0 g、木糖醇 2.0 g、檸檬酸 0.05 g。

2.5 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料理化性質(zhì)

經(jīng)測(cè)定，蛹蟲草、山楂提取物固體飲料潤(rùn)濕性為63 s，分散性為46 s，溶解度為98.35%。樣品溶于水后，潤(rùn)濕和分散時(shí)間較短，溶解度越較大，說明該固體飲料的溶解性越好。

該固體飲料顆粒均勻、細(xì)膩，水分含量低，且未添加任何添加劑；在沖泡后，能均勻的溶于熱水中，不結(jié)塊、不沉淀，說明產(chǎn)品具有良好的流動(dòng)性、分散性及穩(wěn)定性。

2.6 蛹蟲草、山楂提取物固體飲料感官、理化和微生物指標(biāo)

2.6.1 感官指標(biāo)

蛹蟲草、山楂提取物固體飲料為紅棕色、均勻一致的固體，該配方?jīng)_調(diào)于100 mL熱水，溶解性好；口感圓潤(rùn)、酸甜適度，蛹蟲草山楂混合香氣濃郁。

2.6.2 理化指標(biāo)

經(jīng)測(cè)試，蛹蟲草、山楂提取物固體飲料水分含量≤5%；總砷含量（以 As計(jì)）≤0.5 mg/kg；鉛（Pb）含量≤1.0 mg/kg，理化指標(biāo)符合GB/T 29602-2013《固體飲料》標(biāo)準(zhǔn)。

2.6.3 微生物指標(biāo)

經(jīng)測(cè)試，蛹蟲草、山楂提取物固體飲料菌落總數(shù)≤1 000 CFU/g；大腸菌群≤40 MPN/100 g；霉菌和酵母菌≤50 CFU/g；致病菌未檢出，微生物指標(biāo)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用水提醇沉法得到蛹蟲草提取物和山楂提取物，兩種提取物中主要含有多糖、蛋白質(zhì)、黃酮等活性成分，因此以蛹蟲草提取物、山楂提取物為主要原料進(jìn)行蛹蟲草、山楂提取物固體飲料制備工藝研究。通過單因素、正交試驗(yàn)得到最佳配方為蛹蟲草提取物添加量0.5 g、山楂提取物添加量2.0 g、木糖醇添加量2.0 g、檸檬酸添加量0.05 g。將此配方溶于100 mL熱水中，得到溶解性、分散性、流動(dòng)性、穩(wěn)定性良好，營(yíng)養(yǎng)豐富，酸甜可口，具有蛹蟲草獨(dú)特風(fēng)味，便于攜帶的固體飲料。適合各類人群，是具有開發(fā)前景的一種功能飲品。