王小明，陳碧，鐘翠娟，覃逸明，廖政達，謝濟運

（1.廣西科技師范學院食品與生化工程學院，廣西來賓546199；2.廣西科技師范學院科學技術與信息化處，廣西來賓546199）

甜茶（Rubus Suavissimus S.Lee），又名甜葉懸鉤子，屬薔薇科，為懸溝子屬多年生灌木，是我國西南地區(qū)特有的藥食同源植物，甜茶全身都是寶，根、莖、葉、果實等都可入藥，甜茶中含有的類黃酮、茶多酚等物質(zhì)，除具有普通綠茶的功效外，還具有防治高血壓、高血脂、心血管疾病和防癌抗癌等藥效，因此，甜茶在民間被稱之為“神茶”，另外甜茶作為一種天然的甜味料與食品，在西南地區(qū)民間應用已有幾百年的悠久歷史[1-3]。黃酮類化合物是一類廣泛分布于植物體內(nèi)的多酚類物質(zhì)，是一類植物次級代謝產(chǎn)物，其主要類型有黃酮、黃酮醇、異黃酮、雙黃酮和二氫黃酮等，黃酮類化合物是甜茶中重要活性成分之一，從甜茶中提取的黃酮類化合物即為甜茶總黃酮[4-6]。

本研究采用單因素試驗與均勻設計試驗相結合的方法[7]，以粉碎的干甜茶葉粉為原料，以乙醇為萃取溶劑，以甜茶葉中總黃酮的提取得率為指標，研究了纖維素酶-乙醇提取法、乙醇熱回流提取法和超聲波-乙醇提取法對甜茶總黃酮提取得率的影響，并對均勻設計試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析和二次多項式逐步回歸分析研究。均勻設計法適合在考察因素多、水平多的情況下用較少的試驗次數(shù)得到較優(yōu)工藝條件，對比正交試驗法、旋轉(zhuǎn)正交試驗法、響應面分析法等具有方便和迅速的優(yōu)勢，并能將各試驗因素按重要性排序[8-10]。研究得出上述3種方法提取甜茶總黃酮的較優(yōu)工藝條件，并對這3種方法在其各自的較優(yōu)工藝條件下的提取得率進行對比分析，為我國西南地區(qū)甜茶總黃酮的提取利用提供更多理論和可行性操作方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜茶葉采摘于廣西金秀瑤族自治縣蓮花山，甜茶鮮葉清洗干凈后于60℃以下低溫烘干，在粉碎機中粉碎備用。

蘆丁標準品（純度＞99%）：Sigma公司；纖維素酶：山東西唐生物科技有限公司；無水乙醇、硝酸鋁[Al（NO3）3]、亞硝酸鈉（NaNO2）、氫氧化鈉（NaOH）：均為分析純。

UV-1800雙光束紫外可見分光光度計：日本島津；HH-2數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；FS-1500超聲波萃取儀：上海生析超聲儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海姚氏儀器設備廠；Z206A臺式小型離心機：上海趙迪生物科技有限公司；XFB-200小型植物粉碎機：長沙市雨花區(qū)中誠制藥機械廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 總黃酮含量的測定方法[11-14]

準確稱取蘆丁標準品2.500 0 mg，轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，以60%乙醇溶解并定容，配制得0.100 0 mg/mL蘆丁標準溶液。準確移取蘆丁標準溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL容量瓶中，分別加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置10 min；再加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置10 min；再加4%氫氧化鈉溶液4 mL，以60%乙醇定容，搖勻，靜置20 min，從200 nm～700 nm進行全波長掃描，均測得在510 nm處有最大吸光度，因此選定以510 nm為蘆丁和總黃酮濃度的測定波長。在510 nm波長下測各容量瓶中溶液的吸光度，以蘆丁濃度（y）和吸光度（x）進行線性回歸，得線性回歸方程：y=0.081 9x+0.000 1，R2=0.999 8。

1.2.2 甜茶葉中總黃酮含量測定方法

將甜茶葉按不同條件提取的各份提取液過濾離心，按1.2.1中的方法顯色后定容為樣品液，以蒸餾水作空白對照，于510 nm波長下測定樣品液吸光度，將測得的吸光度值代入標準曲線的線性回歸方程，得到樣品液的濃度，并按下面的公式計算得到甜茶葉（樣品液）總黃酮含量（mg）和總黃酮提取得率（%）。

式中：C為樣品液的濃度，mg/mL；V為提取溶液定容的體積，mL；W為甜茶葉的重量，mg。

1.2.3 甜茶葉總黃酮提取工藝流程[15-16]

干燥的甜茶葉→粉碎過篩→分別采取3種提取方法→提取液過濾離心→收集上清液定容→按1.2.1顯色→按1.2.2測定甜茶葉（樣品液）中的總黃酮含量→按1.2.2計算甜茶葉（樣品液）的提取得率（%）

1.2.3.1 維素酶-乙醇提取法

分別準確稱取過50目篩的甜茶葉粉各0.5 g，裝入圓底燒瓶中，并依次加入一定比例量的纖維素酶，加20 mL緩沖液溶解并調(diào)節(jié)pH值，置于恒溫水浴鍋中酶解一定時間后取出，然后將酶解液轉(zhuǎn)移到容量瓶中，加入20 mL 60%乙醇浸提溶劑，再次置于65℃恒溫水浴鍋中回流提取65 min后過濾提取液，于4 500 r/min離心分離，收集上清液定容，測定總黃酮含量并計算出甜茶葉中總黃酮提取得率。

1.2.3.2 乙醇熱回流提取法

分別準確稱取過50目篩的甜茶葉粉各0.5 g，裝入圓底燒瓶中，按一定量加入一定濃度乙醇浸提溶劑，置于恒溫水浴鍋中回流提取一定時間后過濾提取液，于4 500 r/min離心分離，收集上清液定容，測定總黃酮含量并計算出甜茶葉中總黃酮提取得率。

1.2.3.3 超聲波-乙醇提取法

分別準確稱取過50目篩的甜茶葉粉各0.5 g，裝入圓底燒瓶中，按一定量加入一定濃度乙醇浸提溶劑，在超聲波萃取儀中用一定功率，置于恒溫水浴鍋中超聲波萃取一定時間后過濾提取液，于4 500 r/min離心分離，收集上清液定容，測定總黃酮含量并計算出甜茶葉中總黃酮提取得率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗均進行3次平行或重復試驗[17]，試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件、均勻設計（Uniform Design）分析軟件、Origin8繪圖軟件和DPS SOFT7.5進行分析。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶-乙醇提取法

分別準確稱取過50目篩的甜茶葉粉各0.5 g，裝入圓底燒瓶中，以甜茶葉中提取的總黃酮得率為指標進行單因素試驗，分別研究各單因素對纖維素酶-乙醇提取法提取甜茶葉總黃酮的影響。初始條件分別取：纖維素酶添加量3.5 mg、酶解液pH5.0、料液比1 ∶20（g/mL）、酶解溫度 40℃、酶解時間 50 min。選取各因素變量 X1、X2、X3、X4、X5 分別為：纖維素酶添加量（1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 mg）、酶解液 pH 值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，由緩沖液調(diào)節(jié)酶解液 pH值）、酶解溫度（20、30、40、50、60 ℃）、酶解時間（20、35、50、65、80 min），進行單因素試驗。纖維素酶-乙醇提取法各單因素試驗結果如圖1。

根據(jù)四因素十水平的均勻設計，選取均勻設計表U*10（108）。由均勻設計使用表查到，當因素數(shù)為4時，應將各因素依次分別放在U*10（108）表的1、3、4、5列上，其試驗設計和結果如表1、方差分析結果如表2、回歸分析結果如表3。

由圖1可知，纖維素酶-乙醇提取法單因素試驗中，酶添加量最佳值為3.5 mg、酶解液pH值最佳值為5.0、酶解溫度最佳值為40℃、酶解時間最佳值為65 min。

圖1 纖維素酶-乙醇提取法各單因素對提取得率的影響Fig.1 Effect of single factor of cellulase ethanol extraction on extraction yield

表1 纖維素酶-乙醇提取法均勻設計U*10（108）和結果Table 1Cellulase ethanol extraction uniform design U*10（108）and results

表2 纖維素酶-乙醇提取法方差分析結果表Table 2 Results of variance analysis of cellulase and ethanol extraction

表3 纖維素酶-乙醇提取法回歸分析結果表Table 3 Results of regression analysis of cellulase and ethanol extraction

在單因素試驗中各因素最佳值上下近間隔取值，選取四因素十水平的均勻設計表U*10（108）。由表1、表2、表3可知，運用Excel對上述試驗結果進行回歸分析，回歸方程的表達式為：Y=4.404+0.568 Z1+0.794 Z2-0.047 Z3+0.022 Z4。由于復相關系數(shù)R=0.969，P值不顯著的概率＜0.01，所以所建立的四元一次方程非常顯著，與試驗數(shù)據(jù)擬合很好。根據(jù)分析結果中各偏回歸系數(shù)對應的t檢驗值，因素主次順序為：酶解液pH值（Z2）＞酶添加量（Z1）＞酶解溫度（Z3）＞酶解時間（Z4）。根據(jù) P 值可知，酶解液pH值對試驗結果有非常顯著的影響，酶添加量、酶解溫度對試驗結果有顯著的影響。運用Excel中的“規(guī)劃求解”工具，規(guī)劃求解得到本試驗的優(yōu)化工藝條件：酶添加量為4.3 mg、酶解液pH值為5.8、酶解溫度為30℃、酶解時間為77 min，將這些數(shù)值代入回歸方程得Y=11.74%，它優(yōu)于表2中任一試驗結果。經(jīng)驗證試驗，該工藝條件的實際提取得率平均為10.67%，小于表1中第10號試驗結果，因為各因素已經(jīng)是在單因素試驗中各因素最佳值上下近間隔取值，采用直觀分析法，第10號試驗設計的提取得率最大，所以可以確定第10號試驗對應的試驗條件作為纖維素酶-乙醇提取法的較優(yōu)工藝，工藝條件：酶添加量為4.3 mg（0.86%）、酶解液pH值為5.4、酶解溫度為42℃、酶解時間為65 min，此條件下甜茶總黃酮提取得率最大為10.89%。

2.2 乙醇熱回流提取法

分別準確稱50目篩的甜茶葉粉各0.5 g，裝入圓底燒瓶中，以甜茶葉中提取的總黃酮得率為指標進行單因素試驗，分別研究各單因素對乙醇熱回流提取法提取甜茶葉總黃酮的影響。初始條件分別?。阂掖紳舛?5%、甜茶葉與乙醇料液比1∶30（g/mL）、水浴溫度70℃、提取時間80 min。選取各因素變量X1、X2、X3、X4、X5、X6分別為：乙醇濃度（35%、45%、55%、65%、75%、85%）、料液比[1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）]、提取溫度（40、50、60、70、80、90 ℃）、提取時間（40、60、80、100、120、140 min），進行單因素試驗。過濾提取液，于4 500 r/min離心分離，收集上清液定容，測定總黃酮含量并計算出甜茶葉中總黃酮的提取得率。乙醇熱回流提取法各單因素試驗結果如圖2。

根據(jù)四因素十水平的均勻設計，選取均勻設計表U*10（108）。由均勻設計使用表查到，當因素數(shù)為4時，應將各因素依次分別放在U*10（108）表的1、3、4、5列上，其試驗設計和結果如表4、方差分析結果如表5、回歸分析結果如表6。

圖2 乙醇熱回流提取法各單因素對提取得率的影響Fig.2 Effect of single factor of ethanol reflux extraction on extraction yield

表4 乙醇熱回流提取法均勻設計U*10（108）和結果Table 4Uniform design of ethanol reflux extraction U*10（108）and results

表5 乙醇熱回流提取法方差分析結果表Table 5 Results of variance analysis of ethanol reflux extraction method

由圖2可知，乙醇熱回流提取法單因素試驗中，乙醇濃度最佳值為55%、料液比最佳值為1∶50（g/mL）、提取溫度最佳值為70℃、提取時間最佳值為100 min。

表6 乙醇熱回流提取法回歸分析結果表Table 6 Regression analysis results of ethanol reflux extraction method

在單因素試驗中各因素最佳值上下近間隔取值，選取四因素十水平的均勻設計表U*10（108）。由表4、表5、表6可知，運用Excel對上述試驗結果進行回歸分析，回歸方程的表達式為：Y=12.987+0.035 Z1-148.762 Z2-0.030 Z3+0.010 Z4。由于復相關系數(shù)R=0.993，P值不顯著的概率＜0.000 1，所以所建立的四元一次方程高度（十分）顯著，與試驗數(shù)據(jù)擬合很好。根據(jù)分析結果中各偏回歸系數(shù)對應的t檢驗值，因素主次順序為：料液比（Z2）＞乙醇濃度（Z1）＞提取時間（Z4）＞提取溫度（Z3）。根據(jù)P值可知，料液比對試驗結果有高度顯著的影響，乙醇濃度、提取溫度、提取時間對試驗結果有非常顯著的影響。運用Excel中的“規(guī)劃求解”工具，規(guī)劃求解得到本試驗的較優(yōu)工藝條件為：乙醇濃度為63%、料液比為1∶58（g/mL）、提取溫度為60℃、提取時間為120 min，將這些數(shù)值代入回歸方程得Y=12.03%，它優(yōu)于表4中任一試驗結果。經(jīng)驗證試驗，該工藝條件的實際提取得率平均為11.53%，仍優(yōu)于表4中任一試驗結果，因為各因素已經(jīng)是在單因素試驗中各因素最佳值上下近間隔取值，所以可以確定乙醇熱回流提取法的較優(yōu)工藝條件：乙醇濃度為63%、料液比為1 ∶58（g/mL）、提取溫度為 60℃、提取時間為 120 min，此條件下甜茶總黃酮提取得率最大為11.53%。

2.3 超聲波-乙醇提取法

分別準確稱取過50目篩的甜茶葉粉各0.5 g，裝入圓底燒瓶中，以甜茶葉中提取的總黃酮得率為指標進行單因素試驗，分別研究各單因素對超聲波-乙醇提取法提取甜茶葉總黃酮的影響。初始條件分別?。阂掖紳舛?0%、甜茶葉與乙醇料液比1∶30（g/mL）、超聲波功率70 W、提取溫度40℃、提取時間50 min。選取各因素變量 X1、X2、X3、X4、X5、X6 分別為：乙醇濃度（25%、35%、45%、55%、65%、75%）、料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）]、超聲波功率（30、45、60、75、90、115 W）、提取溫度（0、15、30、45、60、75 ℃）、提取時間（10、20、30、40、50、60min），進行單因素試驗。過濾提取液，于4 500r/min離心分離，收集上清液定容，測定總黃酮含量并計算出甜茶葉中總黃酮的提取得率。超聲波-乙醇提取法各單因素試驗結果如圖3。

根據(jù)五因素十水平的均勻設計，選取均勻設計表U*10（108）。由均勻設計使用表查到，當因素數(shù)為5時，應將各因素依次分別放在U*10（108）表的1、2、4、5、7列上，其試驗設計和結果如表7、回歸分析結果如表8。

圖3 超聲波-乙醇提取法各單因素對提取得率的影響Fig.3 Influence of single factor on extraction yield of ultrasonic ethanol extraction method

表7 超聲波-乙醇提取法均勻設計U*10（108）和結果Table 7 Uniform design of ultrasonic and ethanol extraction U*10（108）and results

表8 超聲波-乙醇提取法二次多項式逐步回歸分析結果Table 8 Results of two step polynomial regression analysis of ultrasonic ethanol extraction method

由圖3可知，乙醇熱回流提取法單因素實驗中，乙醇濃度最佳值為65%、料液比最佳值為1∶40（g/mL）、超聲波功率75 W、提取溫度最佳值為45℃、提取時間最佳值為50 min。

在單因素試驗中各因素最佳值上下近間隔取值，選取四因素十水平的均勻設計表U*10（108）。使用DPS SOFT7.5（Data Processing System）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對試驗結果進行回歸分析。經(jīng)方差分析檢驗，線性回歸和逐步回歸方程均不顯著（P值＞0.05），因此不做線性擬合，改為以表7的試驗組合Z1～Z5為自變量，以提取得率Y為因變量對試驗結果進行二次多項式逐步回歸，建立二次多項式回歸方程。并對模型進行顯著性檢驗分析[18-19]，結果如表 8。

由DPS SOFT7.5分析得回歸方程：

Y=18.814 645 45-0.224 296 363 28×Z3-0.002 031 358 597 6×Z12-0.000 051 621 429 36×Z42+0.003 866 813 704×Z1×Z3+0.114 499 978 55×Z2×Z4-0.000 368 058 155 7×Z3×Z4-0.000 414 292 281 9×Z3×Z5+0.000 903 092 816 1×Z4×Z5

由表8可知：回歸模型極顯著（P值=0.005 9＜0.01），回歸方程的決定系數(shù)R2=0.999 993，即方程可以解釋99.999 3%的提取得率數(shù)據(jù)變異，方程的擬合性非常好。因此可以用該回歸方程對試驗的結果進行分析預測。由表8中的t檢驗值和P值分析可知：在試驗所選范圍內(nèi)，單因素對提取得率影響最大為超聲波功率（Z3），達極顯著水平；其他單因素均不顯著。各因素的互交項顯著性表現(xiàn)為，乙醇濃度（Z1）×超聲波功率（Z3）和乙醇濃度（Z1）×乙醇濃度（Z1）的 P 值均達極顯著水平；提取溫度（Z4）×提取時間（Z5）、超聲波功率（Z3）×提取溫度（Z4）和超聲波功率（Z3）×提取時間（Z5）的 P值均達顯著水平；提取溫度（Z4）×提取溫度（Z4）和料液比（Z2）×提取溫度（Z4）的P值對試驗結果影響不顯著。由各變量顯著性P值可知對提取得率影響的大小順序為 Z3＞Z1×Z3＞Z1×Z1＞Z4×Z5＞Z3×Z4＞Z3×Z5＞Z4×Z4＞Z2×Z4。對回歸方程求最大值可以得出：用均勻設計法得出超聲波-乙醇提取法對甜茶總黃酮提取得率的最佳工藝條件為：Z1=68.9，Z2=1 ∶30，Z3=73.9，Z4=62.2，Z5=67.7。即最佳工藝條件為：乙醇濃度68.9%、料液比1∶30（g/mL）、超聲波功率73.9 W、提取溫度62.2℃、提取時間67.7 min。在此工藝條件下，得到提取得率理論值為13.31%。通過驗證試驗，在此優(yōu)化工藝條件下的實際提取得率平均為12.23%，相對誤差僅為8.11%。且此優(yōu)化工藝條件下的實際提取得率優(yōu)于表7中任一試驗結果，因為各因素已經(jīng)是在單因素試驗中各因素最佳值上下近間隔取值，所以可以確定超聲波-乙醇提取法對甜茶總黃酮提取得率的較優(yōu)工藝條件為：乙醇濃度為68.9%、料液比為1∶30（g/mL）、超聲波功率為73.9 W、提取溫度為62.2℃、提取時間為67.7 min，此條件下甜茶總黃酮提取得率最大為12.23%。

2.4 3種提取方法比較

按照3種提取方法的較優(yōu)工藝條件分別進行3次平行試驗，平行試驗結果如表9，方差分析結果如表10。

表9 3種提取方法平行試驗結果Table 9 Parallel experimental results of three extraction methods

表10 3種提取方法平行試驗方差分析Table 10 Parallel experimental variance analysis of three extraction methods

由表9可知，超聲波-乙醇提取法提取得率平均為12.23%＞乙醇熱回流提取得率平均為11.53%＞纖維素酶-乙醇提取法提取得率平均為10.89%。由表10可知，P 值=2.43×10-5＜0.000 1，表明 3 種提取方法對甜茶葉總黃酮提取得率的影響差異達到了高度（十分）顯著水平。

3 結論

通過對甜茶葉中總黃酮的纖維素酶-乙醇提取法、乙醇熱回流提取法和超聲波-乙醇提取法各自提取工藝條件的優(yōu)化及驗證試驗得出纖維素酶-乙醇提取法的較優(yōu)工藝條件：酶添加量為4.3 mg（0.86%）、酶解液pH為5.4、酶解溫度為42℃、酶解時間為65 min，此條件下甜茶總黃酮提取得率最大為10.89%；乙醇熱回流提取法的較優(yōu)工藝條件：乙醇濃度為63%、料液比為1∶58（g/mL）、提取溫度為60℃、提取時間為120min，此條件下甜茶總黃酮提取得率最大為11.53%；超聲波-乙醇提取法的較優(yōu)工藝條件：乙醇濃度為68.9%、料液比為1∶30（g/mL）、超聲波功率為 73.9 W、提取溫度為62.2℃、提取時間為67.7 min，此條件下甜茶總黃酮提取得率最大為12.23%。3種提取方法比較，超聲波-乙醇提取法提取得率平均為12.23%＞乙醇熱回流提取得率平均為11.53%＞纖維素酶-乙醇提取法提取得率平均為10.89%，且3種提取方法對甜茶葉總黃酮提取得率的影響差異達到了高度（十分）顯著水平。

在超聲波-乙醇提取法提取甜茶葉總黃酮工藝中，單因素中對提取得率影響最大為超聲波功率，達極顯著水平；其他單因素均不顯著。各因素的互交項顯著性表現(xiàn)為，乙醇濃度×超聲波功率和乙醇濃度×乙醇濃度對提取得率的影響均達極顯著水平；提取溫度×提取時間、超聲波功率×提取溫度和超聲波功率×提取時間對提取得率的影響均達顯著水平。各變量對提取得率影響的大小順序為 Z3＞Z1×Z3＞Z1×Z1＞Z4×Z5＞Z3×Z4＞Z3×Z5＞Z4×Z4＞Z2×Z4。

4 展望

近年來，類黃酮的生理活性功能不斷被研究證實[20]，學術界也掀起了對其提取和應用研究的高潮。目前涌現(xiàn)出了快速溶劑萃取技術[21]、超臨界流體萃取法[22]、高效逆流色譜法[23]、超濾法[24]等許多高新技術，但這些技術還存在一些不容忽視的問題和局限性，比如有的提取方法仍停留于實驗室研究階段，距離真正的工業(yè)化生產(chǎn)還有一些關鍵技術阻礙等，這些障礙還有待進一步研究突破[25]。而豐富的甜茶資源多生長在我國西南邊窮山區(qū)，對甜茶葉進行綜合開發(fā)利用，探索新的開發(fā)技術，提取其中豐富的類黃酮資源，可以拓寬當?shù)剞r(nóng)民的增收途徑，對扶貧攻堅和全面建成小康社會也具有重要的現(xiàn)實意義。