亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        植物乳桿菌野生質(zhì)粒分析及其提取方法的優(yōu)化

        2018-12-10 06:35:16薩初拉蘇少鋒吳青海其布日王蘊(yùn)華劉紅葵
        畜牧與飼料科學(xué) 2018年11期
        關(guān)鍵詞:條帶乳酸菌基因組

        薩初拉,蘇少鋒,吳青海,其布日,高 娃,王蘊(yùn)華,劉紅葵,呼 和

        (內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031)

        乳酸菌是已知的益生菌之一,目前被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵和食品工業(yè)及飼料中。隨著研究的深入,利用乳酸菌食品級表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)功能性外源基因已成為研究熱點(diǎn)[1-3]。不同于真核生物表達(dá)系統(tǒng),細(xì)菌中存在大量的野生型質(zhì)粒,能夠表達(dá)和遺傳如代謝、抗性相關(guān)的基因,因此,挖掘高拷貝、穩(wěn)定復(fù)制的野生型質(zhì)粒元件和無質(zhì)粒受體菌是構(gòu)建細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的關(guān)鍵[4]。由于乳酸菌為革蘭氏陽性菌,且部分野生型質(zhì)??截悢?shù)低,因此使用傳統(tǒng)堿裂解法或普通質(zhì)粒提取試劑盒提取效果并不理想[4-5]。目前,乳酸菌質(zhì)粒提取方法已有多個報道,但操作均過于復(fù)雜、周期長、毒性大、質(zhì)粒產(chǎn)量低且多數(shù)只適合對數(shù)期乳酸球菌[6-9],因此,該試驗對比研究已報道的兩種常規(guī)方法和優(yōu)化后的方法,最終得到可應(yīng)用于平臺期植物乳桿菌的快速、高效的質(zhì)粒提取方法。利用該方法進(jìn)一步分析野生型植物乳桿菌質(zhì)粒,得到2個高拷貝質(zhì)粒和1個無質(zhì)粒受體菌,為進(jìn)一步開發(fā)和利用植物乳桿菌構(gòu)建食品級表達(dá)系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 試驗試劑及材料

        1.1.1 菌株:菌株QZ21、QZ56和H18由筆者實驗室分離自玉米秸稈青貯,并通過革蘭氏染色方法、APICH50試紙條、16S rDNA鑒定分類為植物乳桿菌屬。

        1.1.2 試劑:DNA分子量Marker購自寶生物工程(大連)有限公司;溶菌酶,酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)溶液購自生工生物工程(上海)股份有限公司;質(zhì)粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;其他試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

        1.1.3 培養(yǎng)基:MRS培養(yǎng)基購自環(huán)凱微生物科技公司。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 質(zhì)粒提取方法:分別取100 μL QZ21、QZ56和H18植物乳桿菌菌液至10 mL MRS液體培養(yǎng)基,32℃,100 r/min培養(yǎng)過夜至平臺期。不同方法各取2 mL同一培養(yǎng)物進(jìn)行質(zhì)粒提取對比分析。

        1.2.1.1 質(zhì)粒提取方法Ⅰ:將Klaenhammer等發(fā)表的方法進(jìn)行細(xì)微改動。取2 mL過夜培養(yǎng)植物乳桿菌,12 000 r/min離心1 min收集菌體;加入solutionⅠ(25%sucrose,30 mg/mL 溶菌酶)重懸,并置于 37 ℃,孵育 15 min;隨后加入 400 μL SolutionⅡ(3%SDS,0.2 mol/L NaOH),立即混勻,室溫孵育7 min 后; 加入 300 μL 乙酸鈉 (3 mol/L,pH 值4.8),立即混勻,12 000 r/min,離心 15 min;將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管,加入650 μL異丙醇, 混勻,12 000 r/min,4℃離心,15 min; 棄上清液,320 μL ddH2O 重懸沉淀,加入 200 μl 7.5 mol/L乙酸銨和0.5 mg/ml溴化乙錠溶液,混勻,再加入350 μL酚—氯仿溶液,混勻,12 000 r/min離心5 min;將得到的上清用乙醇沉淀,30 μL 1×TE溶解沉淀。

        1.2.1.2 質(zhì)粒提取方法Ⅱ:根據(jù)萬謙等[4]發(fā)表的方法。取2 mL過夜培養(yǎng)植物乳桿菌12 000 r/min離心1 min收集菌體;加入250 μL L-P1溶液 (20 mg/mL溶菌酶溶解于P1溶液中)重懸沉淀,37℃處理 30 min;12 000 r/min離心1 min,將上清液完全去除;其余步驟按試劑盒說明書進(jìn)行操作。最終產(chǎn)物溶于 30 μL 1×EB。

        1.2.1.3 質(zhì)粒提取方法Ⅲ:取2 mL過夜培養(yǎng)植物乳桿菌12 000 r/min離心1 min收集菌體;加入400 μL丙酮混勻;12 000 r/min離心1 min收集菌體。后續(xù)同方法Ⅱ。

        1.2.2 質(zhì)粒電泳:各取10 μL上述質(zhì)粒,加入2 μL 6×上樣緩沖液,混勻。使用含有核酸染料的1%瓊脂糖凝膠,以3~4 V/cm進(jìn)行電泳檢測,紫外成像儀進(jìn)行拍照記錄。

        1.2.3 定量分析:各取2.5 μL上述質(zhì)粒,使用ddH2O稀釋200倍。使用貝克曼DU640紫外分光光度計對260、280 nm處的吸光值進(jìn)行分析,得到其核酸濃度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 質(zhì)粒提取結(jié)果

        該研究對比2種常規(guī)乳酸菌質(zhì)粒提取方法,通過提取青貯分離植物乳桿菌野生型質(zhì)粒后進(jìn)行電泳分析,由圖1可知,方法Ⅰ和Ⅱ均能夠檢測到QZ21和QZ56在2 000 bp上下有2條野生型質(zhì)粒條帶,且2種方法得到的條帶并無明顯差異。然而H18菌株除了染色體條帶以外并未檢測到明顯的質(zhì)粒條帶。為進(jìn)一步提高質(zhì)粒提取效率,該研究在前期試驗的基礎(chǔ)上以簡便、毒性低的方法Ⅱ為基礎(chǔ),利用丙酮進(jìn)行前期處理平臺期植物乳桿菌形成方法Ⅲ,并與方法Ⅰ和Ⅱ進(jìn)行了對比分析。如圖1所示,方法Ⅲ得到的QZ21和QZ56條帶相對于方法Ⅰ和Ⅱ更加清晰,說明丙酮前期處理能夠提高植物乳桿菌質(zhì)粒提取效率。但同樣方法Ⅲ提取H18質(zhì)粒后并未檢測到明顯的質(zhì)粒條帶,推測H18可能為無質(zhì)粒植物乳桿菌。

        2.2 質(zhì)粒濃度結(jié)果

        圖1 質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果

        表1 紫外分光光度計分析質(zhì)粒濃度結(jié)果

        為進(jìn)一步量化質(zhì)粒提取結(jié)果,該試驗采用紫外分光光度計測量相同體積質(zhì)粒提取物中的DNA含量。測得結(jié)果如表1所示,方法Ⅰ所得到的質(zhì)粒提取物中總的DNA含量明顯高于方法Ⅱ,但從電泳結(jié)果可知方法Ⅰ所得質(zhì)粒提取物中基因組DNA的污染比例明顯高于方法Ⅱ,說明方法Ⅰ所得質(zhì)粒提取物中純質(zhì)粒的含量較少。同樣改良后的方法Ⅲ的質(zhì)粒提取物中基因組DNA的比例也較高,可能由于丙酮前期處理后增加了細(xì)菌的裂解率,從而也提高了質(zhì)粒的提取率。由于常規(guī)質(zhì)粒提取過程中無法完全排除細(xì)菌基因組的污染,尤其是在革蘭氏陽性細(xì)菌質(zhì)粒提取過程中,所以只能在保證質(zhì)粒提取量的前提下,盡量減少基因組的污染。

        3 討論

        質(zhì)粒提取效率受到細(xì)菌濃度、生長時期、提取方法、質(zhì)粒濃度和物種等多個因素的影響[10]。目前已有多個有效乳菌質(zhì)粒提取方法的報道[4-9]。其中多數(shù)均以乳酸菌為研究對象[4-5,7-8],而植物乳桿菌質(zhì)粒提取有效方法報道較少,且多數(shù)研究使用對數(shù)生長期的乳酸菌[4-8],然而獲得對數(shù)生長期的細(xì)菌時需要不斷監(jiān)測,且需要大量的培養(yǎng)物來達(dá)到所需的質(zhì)粒提取量。平臺期培養(yǎng)物通常可以從過細(xì)菌液培養(yǎng)物得到,并且菌液濃度也會最大,因此如果能利用平臺期植物乳桿菌進(jìn)行有效質(zhì)粒提取,則能夠節(jié)省人力的同時,保障得到高濃度質(zhì)粒。植物乳桿菌野生型質(zhì)粒的拷貝數(shù)較低,且平臺期細(xì)胞膜較厚,因此常規(guī)方法很難有效裂解平臺期植物乳桿菌細(xì)胞壁,需要對現(xiàn)有方法進(jìn)行改進(jìn),從而獲得可廣泛應(yīng)用于平臺期植物乳桿菌的快速、高效質(zhì)粒提取方法。

        由上述電泳及紫外定量結(jié)果可知,所得到的質(zhì)粒濃度依照使用方法不同而不同。其中方法Ⅲ得到的DNA濃度最大,其次方法Ⅰ,而方法Ⅱ得到的DNA濃度最低。方法Ⅲ具有高效率的首要原因可能是在質(zhì)粒提取過程中使用了強(qiáng)通透劑——丙酮。這一過程大大增加了植物乳桿菌細(xì)胞壁通透性,從而為溶菌酶進(jìn)一步裂解細(xì)胞壁提供了良好的基礎(chǔ)[9]。利用方法Ⅰ檢測植物乳桿菌質(zhì)粒通常是可行的,但由于方法Ⅰ操作過程過于復(fù)雜,并且存在EB污染風(fēng)險,因此并不利于常規(guī)操作。方法Ⅱ應(yīng)用于乳酸球菌質(zhì)粒提取時具有很高的效率,但應(yīng)用于植物乳桿菌質(zhì)粒提取過程中時卻不盡人意。由此可知,并非所有乳酸球菌質(zhì)粒提取方法均適用于其他乳酸菌的質(zhì)粒提取,因此,需要依照不同的物種,對質(zhì)粒提取方法進(jìn)行優(yōu)化及改進(jìn)。方法Ⅰ得到的DNA總濃度雖然比方法Ⅱ得到的大,但依照電泳結(jié)果可知方法Ⅰ得到的質(zhì)粒提取物中基因組DNA污染較大,而方法Ⅱ使用了過柱純化方法,因此有效降低了基因組DNA的污染比例。

        該研究為建立快速有效的植物乳桿菌質(zhì)粒提取方法,在方法Ⅱ的基礎(chǔ)上增加了丙酮處理過程,從而提高了植物乳桿菌質(zhì)粒獲得率,建立了適合于平臺期植物乳桿菌快速、高效質(zhì)粒提取方法。利用該方法進(jìn)一步分析野生型植物乳桿菌QZ21、QZ56和H18的質(zhì)粒,得到2個高拷貝質(zhì)粒和1個無質(zhì)粒植物乳桿菌。其中高拷貝質(zhì)??梢愿脑鞛楸磉_(dá)載體,而無質(zhì)粒植物乳桿菌可以作為方便的受體菌株。

        由于乳酸菌的益生作用和食品領(lǐng)域應(yīng)用潛力,目前已被越來越多的研究團(tuán)隊所關(guān)注。如何開發(fā)利用乳酸菌作為轉(zhuǎn)基因技術(shù)、制藥、食品加工及飼料等領(lǐng)域的生物媒介是關(guān)鍵。其中乳酸菌工程菌的制備及相應(yīng)載體的構(gòu)建是基礎(chǔ),然而在此過程中,乳酸菌質(zhì)粒提取是重要的技術(shù)手段。乳酸球菌質(zhì)粒提取方法雖然已被廣泛報道,但植物乳酸桿菌質(zhì)粒的快速、高效提取方法仍需進(jìn)一步優(yōu)化。該試驗中,通過對比分析不同試驗方法的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步優(yōu)化,得到了快速有效的植物乳桿菌質(zhì)粒提取方法,最終利用該方法獲得了構(gòu)建植物乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)所需高拷貝質(zhì)粒和受體菌株,為構(gòu)建植物乳桿菌表達(dá)系統(tǒng)奠定基礎(chǔ)。

        猜你喜歡
        條帶乳酸菌基因組
        禽用乳酸菌SR1的分離鑒定
        牛參考基因組中發(fā)現(xiàn)被忽視基因
        基于條帶模式GEOSAR-TOPS模式UAVSAR的雙基成像算法
        基于 Savitzky-Golay 加權(quán)擬合的紅外圖像非均勻性條帶校正方法
        乳酸菌成乳品市場新寵 年增速近40%
        乳飲品中耐胃酸乳酸菌的分離鑒定與篩選
        中國釀造(2014年9期)2014-03-11 20:21:04
        基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化
        遺傳(2014年3期)2014-02-28 20:58:49
        有趣的植物基因組
        一種基于MATLAB的聲吶條帶圖像自動拼接算法
        海岸工程(2014年4期)2014-02-27 12:51:28
        產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選及誘變育種
        国产av乳头久久一区| 国产亚洲av综合人人澡精品| 国产精品久久久久久久久KTV| 级毛片无码av| 激情综合色五月丁香六月亚洲| 性饥渴艳妇性色生活片在线播放| 久久久久亚洲AV片无码乐播| 久久精品亚洲热综合一本色婷婷| 亚洲一区二区三区小说| 99精品热这里只有精品| 精品亚洲女同一区二区| 成人性生交大片免费看激情玛丽莎| 国产精品久久久福利| 午夜精品久久久久成人| 国产高清a| 快射视频网站在线观看| 欧美牲交a欧美牲交aⅴ| 两个人看的www高清视频中文| 中国免费av网| 人妖啪啪综合av一区| 成人欧美日韩一区二区三区| 99精品电影一区二区免费看| 美女福利一区二区三区在线观看| 在线观看 国产一区二区三区| 国产亚洲日本精品无码| 久久亚洲道色宗和久久| 青青草视频在线观看视频免费 | 国产精品国产自产自拍高清av| 亚洲精品久久一区二区三区777| 国产午夜视频在永久在线观看| 中文字幕乱码亚洲美女精品一区| 国产毛片av最新视频| 欧美国产一区二区三区激情无套| 在线天堂中文一区二区三区| 亚洲人成精品久久熟女| 射精专区一区二区朝鲜| 亚洲香蕉视频| 国产一级黄片久久免费看| 成熟了的熟妇毛茸茸| 国产第一页屁屁影院| 人妻av一区二区三区高|