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(1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽 550025;2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽 550025;3.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,貴州貴陽 550025)

酶是一種可再生能源,在溫和條件下,以高區(qū)域選擇性和立體選擇性發(fā)生酶促反應(yīng),被廣泛應(yīng)用于食品、制藥、化工等領(lǐng)域[1-2]。但在某些惡劣條件下,酶易變性和失活,這限制了它們的應(yīng)用。因此,長(zhǎng)期以來,人們都在不斷努力開發(fā)有效的固定技術(shù)以增加酶的穩(wěn)定性,并促進(jìn)它們的回收和再循環(huán)。20世紀(jì)60年代,Doscher等[3]首次通過戊二醛與蛋白質(zhì)表面上的反應(yīng)性NH2基團(tuán)反應(yīng)產(chǎn)生了蛋白質(zhì)交聯(lián)技術(shù)。隨后,該技術(shù)被用于結(jié)晶酶的交聯(lián)以生產(chǎn)交聯(lián)酶晶體(CLEC)[4]。但CLEC需要高純度酶并使酶結(jié)晶,該過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此,Cao等[5]在此基礎(chǔ)上通過沉淀酶代替結(jié)晶過程,并交聯(lián)所得到的物理聚集體。從此,一種新型固定化酶技術(shù)產(chǎn)生-CLEAs技術(shù)。

CLEAs技術(shù)操作十分簡(jiǎn)單,僅需要經(jīng)過沉淀和交聯(lián)兩步。在沉淀過程中,酶分子通過非共價(jià)鍵結(jié)合在一起發(fā)生沉降,該過程不會(huì)擾亂它們的三級(jí)結(jié)構(gòu)。而交聯(lián)主要是雙功能交聯(lián)劑通過在相鄰酶分子表面上與賴氨酸殘基的游離氨基發(fā)生反應(yīng),形成由分子間和分子內(nèi)羥醛縮合產(chǎn)生的低聚物或聚合物,該過程涉及席夫堿形成和邁克爾型1,4加成到α,β-不飽和醛部分(圖1)。因此,通過該技術(shù)制得的CLEAs能夠很好地保留酶原始催化活性,并提高儲(chǔ)存穩(wěn)定性和操作穩(wěn)定性[6-7]。被廣泛應(yīng)用于水解酶、氧化還原酶以及裂合酶等多種酶CLEAs制備中。同時(shí),該技術(shù)還可用于制備催化多種生物轉(zhuǎn)化的multi-CLEAs,這不僅避免了不穩(wěn)定中間體的積累,還能減少二次不良反應(yīng)[8-9]。

圖1 交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)制備方法Fig.1 Cross-linked enzyme aggregates(CLEAs)preparation strategy

目前,CLEAs技術(shù)不斷被用于不同種類和不同來源的酶固定化當(dāng)中,而粒徑、活力以及穩(wěn)定性是評(píng)價(jià)CLEAs性能的重要指標(biāo)。因此本文從粒徑、改善CLEAs活力和提高穩(wěn)定性等方面進(jìn)行綜述,以期對(duì)CLEAs的商業(yè)化生產(chǎn)提供一定的指導(dǎo)作用。

1 CLEAs的大小與形態(tài)

粒徑是制備CLEAs的重要參數(shù),它直接決定了CLEAs顆粒的尺寸[10]。合適的尺寸CLEAs不僅有利于產(chǎn)品的分離與回收利用,還能提供最佳的反應(yīng)物表面積和擴(kuò)散速度。通常,CLEAs的大小為1～100 μm,按形態(tài)分為I型、II型和簇[11-12]。I型CLEAs直徑約為1 μm,如CAL-B,每個(gè)CLEA含有8×108個(gè)酶分子,呈現(xiàn)球形聚集體,它們主要由低糖基化酶和大疏水表面組成;II型CLEAs直徑小于0.1 μm,由具有大親水性表面和高糖基化水平的酶組成,這種類型的CLEAs中每個(gè)CLEA存在大約1×104個(gè)酶分子,呈不規(guī)則形狀,且小于類型I;CLEAs可能形成較大尺寸(>1 μm)的聚集體,稱為“簇”。簇的形成會(huì)存在傳質(zhì)限制,導(dǎo)致CLEAs內(nèi)部的酶分子不能很好地與底物接觸,降低CLEAs酶活。然而,CLEAs粒徑過小又會(huì)使得酶分子過多地暴露于有機(jī)溶劑體系中,不利于酶活性。因此,有必要了解并控制CLEAs大小,為明確調(diào)控CLEAs結(jié)構(gòu)和催化性能鋪平道路。

2 粒徑的調(diào)控方式

2.1 減少傳質(zhì)限制

在CLEAs制備中應(yīng)減少“簇”的形成。增加攪拌速度和攪拌時(shí)間來減小CLEAs的大小是實(shí)現(xiàn)傳質(zhì)的增加和保留酶原始活性的常見方法。往復(fù)式細(xì)胞破碎機(jī)和渦流是常采用的減少“簇”傳質(zhì)限制的方式。渦旋攪拌90 min可以恢復(fù)80%的初始活性[13],使用往復(fù)式細(xì)胞破碎機(jī)則可以在30～60 s的處理時(shí)間內(nèi)快速減少CLEAs的大小,從而恢復(fù)100%的活性。但在使用往復(fù)式細(xì)胞破碎機(jī)和渦流過程中應(yīng)注意控制力度以免破壞CLEAs的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。此外,CLEAs顆粒大小也會(huì)影響擴(kuò)散速度,從而影響整個(gè)催化反應(yīng)速率,需對(duì)交聯(lián)劑/酶的比率進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。

2.2 調(diào)節(jié)pH

近年來,不少研究指出CLEAs粒徑也可能會(huì)受到pH的影響,這主要與戊二醛(GA)的性質(zhì)有關(guān)。在酸性pH下,水溶液中GA的分子量類似于GA單體的環(huán)狀半縮醛,交聯(lián)步驟中,這類分子發(fā)生的分子間相互作用是短而有序的;而在堿性pH下,GA傾向于聚合形態(tài),這導(dǎo)致在酸性和堿性條件下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)得到的最終產(chǎn)物不同[14]。基于上述原理,人們可通過調(diào)節(jié)pH改變聚集體大小。Caballero等[15]研究了GA溶液pH對(duì)粒徑影響,發(fā)現(xiàn)在pH4.5和pH9.5下使用GA制備CLEAs存在顯著差異,表明GA溶液pH會(huì)對(duì)CLEAs結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響,并且還發(fā)現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)變化對(duì)CLEAs活性也有顯著影響(圖2)。

圖2 GA溶液pH4.5和9.5下制備的CLEAs光學(xué)顯微鏡照片[15]Fig.2 Optic microscopy photographs of cross-linked enzyme aggregates(CLEAs)using glutaraldehyde at pH4.5 and 9.5[15]注:a為用戊二醛在pH4.5,戊二醛濃度為35 mmol/L和酶/白蛋白比為15時(shí)制備的CLEAs;b為用戊二醛在pH9.5,戊二醛濃度為35 mmol/L和酶/白蛋白比為15時(shí)制備的CLEAs;圖2右下方的藍(lán)線表示100 μm的距離[15]。

2.3 選擇交聯(lián)方式

按沉淀與交聯(lián)之間的時(shí)間段可將交聯(lián)分為兩種,一種是將使酶完全沉淀后或沉淀后放置一段時(shí)間再交聯(lián),也稱后熟處理;另一種則是在沉淀過程中立即引入交聯(lián)劑交聯(lián),這種操作能夠節(jié)省時(shí)間和成本[16]。從交聯(lián)機(jī)理上來說,兩種交聯(lián)方式的主要區(qū)別在于前者是聚集體顆粒表面被交聯(lián),而后者可能涉及到分子在聚集體內(nèi)部進(jìn)行交聯(lián)。用新鮮(在沉淀后立即交聯(lián))與成熟(在4 ℃下存放7 d后交聯(lián))的青霉素?；?PA)進(jìn)行交聯(lián)酶聚集體制備發(fā)現(xiàn)成熟的CLEAs比新鮮CLEAs的尺寸更大,表明聚集體的大小可以通過對(duì)PA的共價(jià)修飾程度來調(diào)節(jié)[17]。對(duì)于后熟處理而言,該過程涉及長(zhǎng)時(shí)間的沉淀,可能導(dǎo)致酶活力下降。因此,在實(shí)驗(yàn)過程中需根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的交聯(lián)方式。

2.4 調(diào)節(jié)沉淀劑濃度

沉淀劑濃度會(huì)改變聚集體表面的疏水/親水殘基數(shù)量發(fā)生變化。當(dāng)沉淀劑濃度增加時(shí),疏水殘基隨之增加,而疏水殘基會(huì)傾向于產(chǎn)生1 μm的大孔洞,從而增加CLEAs粒徑。反之親水殘基則會(huì)形成0.1 μm的小孔洞,由此影響CLEAs的大小。通過掃描電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)高飽和度硫酸銨沉淀制得的CLEAs表面孔洞更多,粒徑也更大[18]。

2.5 結(jié)合反膠團(tuán)沉淀

將適量的水和表面活性劑溶于有機(jī)溶劑中,并使表面活性劑濃度超過臨界膠束濃度可形成反膠束,該法可用于酶、蛋白質(zhì)、核酸等生物活性物質(zhì)的提取[19]。Chen等[20]首次從二氧化碳分散的反膠束溶液沉淀胰蛋白酶進(jìn)行交聯(lián),獲得了納米級(jí)別的樹狀CLEAs(7～38 nm)(如圖3)。這種方法通過改變水-表面活性劑比例(w0)和酶在反膠束溶液中的濃度使得CLEAs的直徑發(fā)生變化,從而精確地控制它們的尺寸。與常規(guī)方法相比,此方法制備的CLEAs具有更高活性。

圖3 CO2分散反膠束溶液制備交聯(lián)酶聚集體(CLEAs)的TEM照片[20]Fig.3 TEM photographs of cross-linked enzyme aggregates(CLEAs)from the CO2-expanded reverse micellar solutions[20]注:a表示w0=20,胰蛋白酶0.5 mg/mL;表示bw0=40,胰蛋白酶0.5 mg/mL;c表示w0=40,胰蛋白酶1.0 mg/mL[20]。

CLEAs的粒徑不僅影響其微觀結(jié)構(gòu),同時(shí)也與酶活性相關(guān)。有研究報(bào)道了五種納米粒子(NPs)(納米TiO2,納米MgO,納米Ni,納米Cu和納米Fe3O4)對(duì)CLEAs活性和結(jié)構(gòu)的影響,其中添加納米TiO2會(huì)使CLEAs顆粒尺寸更小并產(chǎn)生更多的通道,這種結(jié)構(gòu)的改變使CLEAs的Km降低和Vmax增加,從而有利于CLEAs活性。而對(duì)于其他四種NPs而言,它們的加入不能形成較多的無定形空腔,反而產(chǎn)生更大或更離散的粒徑,因此CLEAs活性降低[12]。然而,如何精確控制CLEAs的大小實(shí)現(xiàn)酶尺寸的定制,目前仍然處于研究階段。

3 改善CLEAs活力的因素

CLEAs活力是評(píng)價(jià)交聯(lián)酶聚集體性能的重要指標(biāo),除上述提到的粒徑影響因素外,CLEAs活力還受沉淀劑、交聯(lián)劑、酶濃度以及添加劑等多種因素的影響。

3.1 沉淀劑

不同的酶組成的氨基酸序列不同,故采用不同的沉淀劑進(jìn)行沉淀存在差異[21],因此制備的CLEAs活性也會(huì)有所差異。Devi等[22]研究了四種類型的沉淀劑對(duì)南極假絲酵母脂肪酶B(CAL-B)CLEAs的影響,發(fā)現(xiàn)PEG和飽和硫酸銨沉淀的CLEAs具有優(yōu)良的活性。脂肪酶CLEAs活性回收率會(huì)隨沉淀劑類型和酶來源而發(fā)生變化,這是由于不同微生物來源的脂肪酶糖基化表面不同,使用不同的沉淀試劑會(huì)形成不同的聚集、包裝和配置蛋白質(zhì)分子[22-23]。此外,有機(jī)溶劑作沉淀劑可能會(huì)除去蛋白質(zhì)表面的水分,導(dǎo)致酶活性降低。有研究[24]提出通過添加葡萄糖、海藻糖和蔗糖物質(zhì)來輔助沉淀可增強(qiáng)CLEAs在有機(jī)溶劑沉淀下的穩(wěn)定性。最佳沉淀劑并不一定會(huì)制備出最佳CLEAs,因?yàn)樽罴殉恋韯┎⒉灰馕吨苷T導(dǎo)出更有利于酶活性的構(gòu)象[1]。

3.2 交聯(lián)劑

目前,CLEAs中最常使用的交聯(lián)劑是GA,因其易商業(yè)獲得被廣泛用于水解酶、氧化酶、裂解酶等CLEAs制備。但大量研究發(fā)現(xiàn)使用GA作交聯(lián)劑并不總能獲得理想的效果。因此有必要研究開發(fā)其他交聯(lián)劑。

3.2.1 新型交聯(lián)劑的開發(fā) Talekar等[25]最早提出用果膠作交聯(lián)劑,這種高度生物相容的自然多糖在高碘酸鹽介導(dǎo)的氧化作用下能在單體單元的C2和C3鍵處被特異性切割,形成兩個(gè)反應(yīng)性醛基,這些生成的二醛基團(tuán)對(duì)賴氨酸殘基中的氨基特別活潑,可形成席夫堿,從而替代GA成為一種可再生且無毒的交聯(lián)劑[26]。一些溫和的交聯(lián)劑如乙二醇-雙[琥珀酸N-羥基琥珀酰亞胺](EG-NHS)可以取代GA制備青霉菌脂肪酶CLEAs,該交聯(lián)劑主要通過N-羥基琥珀酰亞胺酯形成穩(wěn)定的酰胺鍵來交聯(lián)蛋白質(zhì),制得的EG-NHS聚集體較戊二醛具有更優(yōu)異的水解和酯化活性[13,27](圖4)。有研究[28]表明CAL-B-CLEA的熱穩(wěn)定性對(duì)所用雙環(huán)氧化物的交聯(lián)度及鏈長(zhǎng)度具有很強(qiáng)的依賴性。苯醌也被報(bào)道用作交聯(lián)劑,且在50 ℃條件下90 min的熱穩(wěn)定性比用GA制備的CLEAs高5倍[29]。對(duì)于一些酶而言,小分子的交聯(lián)劑可能會(huì)進(jìn)入蛋白質(zhì)內(nèi)部破壞其三級(jí)結(jié)構(gòu),導(dǎo)致酶活性完全喪失,因此不少研究致力于開發(fā)葡聚糖和殼聚糖等大分子制備交聯(lián)酶聚集體[30-31]。

圖4 蛋白質(zhì)(a)經(jīng)由戊二醛的和(b)乙二醇雙[琥珀酸N-羥基琥珀酰亞胺]交聯(lián)Fig.4 Crosslinking of proteins(a)via Glutaraldehyde and(b)Ethylene glycolbis[succinimidylsuccinate]

3.2.2 交聯(lián)劑濃度與交聯(lián)時(shí)間的控制 交聯(lián)劑濃度與交聯(lián)時(shí)間會(huì)影響CLEAs活性和穩(wěn)定性。Majumder等[32]用三種不同濃度(10、40、60 mmol/L)的GA生產(chǎn)CLEAs時(shí)發(fā)現(xiàn)較高交聯(lián)度下熱穩(wěn)定性增加;但是活性和對(duì)映選擇性受損,這是因?yàn)镃LEAs的形態(tài)受交聯(lián)度的影響,濃度增加會(huì)引起分子剛性程度增大,導(dǎo)致催化活性降低。而交聯(lián)時(shí)間對(duì)CLEAs活性的影響主要在于長(zhǎng)時(shí)間的交聯(lián)會(huì)產(chǎn)生交聯(lián)過度、粒徑增大、酶活性被掩蓋等問題,而交聯(lián)時(shí)間過短,則交聯(lián)不足,導(dǎo)致CLEAs在浸入水中時(shí)過于柔軟且不穩(wěn)定[33]。因此,在CLEAs制備中,應(yīng)選擇適宜的交聯(lián)劑濃度并合理控制交聯(lián)時(shí)間,以提高CLEAs的活力。

3.3 酶濃度

酶濃度也是影響CLEAs活性的重要因素。有研究發(fā)現(xiàn)在一定的酶濃度(10～40 mg/mL)范圍內(nèi)熒光假單胞菌脂肪酶CLEAs的活性會(huì)隨著酶濃度的增加而增加,這是由于酶濃度的增加會(huì)有更多的酶分子被固定[34]。但酶濃度過高會(huì)使CLEAs顆粒增大,導(dǎo)致酶的活性中心與底物分子接觸受阻,同時(shí)還會(huì)降低反應(yīng)體系中的水分含量使酶分子變性失活。因此,在酶濃度可調(diào)節(jié)的情況下,應(yīng)對(duì)酶濃度加以選擇,以制備較高活力的CLEAs。

3.4 添加劑

孫立梅[35]，Bashir F[36]等研究表明在蛋白質(zhì)濃度低的酶制劑中添加牛血清白蛋白可以促進(jìn)CLEAs形成,這可能涉及到BSA可以提供更多的賴氨酸基團(tuán)。在CLEAs中添加表面活性劑SDS或庚烷會(huì)增加酶的表面積,因?yàn)楦楹褪杷苑肿涌梢允笴LEAs周圍的水分子重新排列,同SDS一樣起到界面活化作用,使活性位點(diǎn)增加,給予底物提供更好的附著機(jī)會(huì)[37]。覆蓋酶活性位點(diǎn)的蓋子可在各種印記分子存在的界面處開啟,因此在CLEAs制備中可通過添加油酸印跡增加酶表面殘基之間靜電和氫鍵的相互作用[38],對(duì)于酶分子表面含有少量或不含賴氨酸殘基導(dǎo)致交聯(lián)不足產(chǎn)生CLEAs不穩(wěn)定和活力低的現(xiàn)象,可添加伯氨基的聚合物,如聚賴氨酸和聚乙烯亞胺來解決這一問題,同時(shí)后者可形成帶正電荷的微環(huán)境,能夠阻止有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)之間的接觸,從而提高CLEAs穩(wěn)定性[39]。Triton X-100的加入會(huì)增加傾向于形成二聚體的脂肪酶的活性,例如棉狀嗜熱絲孢菌(TLL),而CAL-B幾乎不受Triton X-100存在的影響[40]。表面活性劑和冠醚對(duì)脂肪酶有活化作用,這通常歸因于誘導(dǎo)酶產(chǎn)生了更有利于活性的構(gòu)象。添加劑不與酶共價(jià)結(jié)合,因此可以使用合適的有機(jī)溶劑將其從CLEAs中輕松沖洗出來,從而使固定化酶保持有利的催化構(gòu)象[41]。

4 增強(qiáng)CLEA穩(wěn)定性的策略

4.1 調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)參數(shù)

大量研究表明CLEAs固定化能夠提高酶的穩(wěn)定性。但是在不同的商業(yè)應(yīng)用中對(duì)CLEAs的穩(wěn)定性要求存在差異,故需適時(shí)做出調(diào)整。一般來說,分子間和分子內(nèi)共價(jià)鍵的數(shù)量越多,熱穩(wěn)定性越強(qiáng)。即可通過增加酶的剛性程度來提高穩(wěn)定性。因此在CLEAs制備期間,可以通過調(diào)節(jié)交聯(lián)時(shí)間,交聯(lián)劑濃度和交聯(lián)劑等實(shí)驗(yàn)參數(shù)來提高CLEAs穩(wěn)定性。Kopp等[42]以叔丁醇做沉淀制備青霉素G?；D(zhuǎn)移酶CLEAs,其熱穩(wěn)定性高于DME和PEG,董濤等[43]在制備氨基?；附宦?lián)聚集體選用叔丁醇做沉淀也得到了類似的結(jié)果。此外,在CLEAs制備過程中加入帶電聚合物聚乙烯亞胺(PEI)可增強(qiáng)CLEAs的穩(wěn)定性,Pan等[44]使用PEI作為共沉淀劑制備粘質(zhì)沙雷氏菌粘附分枝桿菌脂肪酶與聚乙烯亞胺(CLECAs-SML-PEI)的交聯(lián)酶共聚集體,發(fā)現(xiàn)熱穩(wěn)定性有顯著提高。

4.2 氨基酸改善

目前,有研究提出在交聯(lián)過程中加入適當(dāng)?shù)陌被峥墒菇宦?lián)酶聚集體更穩(wěn)定,因?yàn)楫?dāng)游離氨基酸與蛋白質(zhì)共存時(shí),氨基酸可通過-NH2或胍基與蛋白質(zhì)形成交聯(lián),此過程還涉及電荷改變,如加入Arg可以使蛋白質(zhì)聚集體帶上一個(gè)負(fù)電荷,而Asp則會(huì)使蛋白質(zhì)聚集體帶上多個(gè)負(fù)電荷[45]。而且每個(gè)氨基酸的加入都會(huì)在不同程度上增加側(cè)鏈中的-(CH2)n,而戊二醛在溶液中也會(huì)形成-(CH2)n,導(dǎo)致同時(shí)交聯(lián)[46]。Mukherjee等[47]研究了Arg,Lys,Ala,Asp對(duì)幾種脂肪酶的影響,發(fā)現(xiàn)在形成CLEAs期間添加氨基酸能使生物催化劑更穩(wěn)定。然而,不同的蛋白質(zhì)的疏水化和親水化存在差異,且在某些情況下交聯(lián)可能是通過胍基而不是Lys形成[44-48],因此對(duì)不同來源和類型的酶在CLEAs制備中,我們應(yīng)據(jù)實(shí)際情況選擇合適的氨基酸來進(jìn)行化學(xué)修飾。

4.3 結(jié)合其他固定化技術(shù)制備CLEAs

4.3.1 分子篩載體CLEAs制備 在聚合物或基質(zhì)中對(duì)CLEAs進(jìn)行包封能夠增加其穩(wěn)定性。Wilson等[44]將青霉素?；D(zhuǎn)移酶CLEAs包封在聚乙烯醇水凝膠內(nèi)能夠顯著提高穩(wěn)定性。采用先吸附后交聯(lián)的方法可在二氧化硅基質(zhì)的內(nèi)孔中制備胰凝乳蛋白酶和爪哇毛霉脂肪酶CLEAs,這些37 nm小孔通過直徑為13 nm的通道連接,使得CLEAs不能通過該通道并保留在毛孔中。并且為防止載體CLEAs的浸出和抑制糜蛋白酶自溶,該實(shí)驗(yàn)在200 r/min下攪拌2周以研究CLEAs的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)酶活基本沒有降低[49]。國(guó)內(nèi)也有研究報(bào)道了將CLEAs與氨基化硅膠共價(jià)交聯(lián)來提高CLEAs的重復(fù)使用性和儲(chǔ)藏穩(wěn)定性[50]。黎克純等[51]使用大孔的菲環(huán)骨架為載體固定交聯(lián)淀粉酶聚集體,使其熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性都顯著提高,而且在重復(fù)反應(yīng)7批次后,相對(duì)活性仍保留63.29%。

4.3.2 磁性CLEAs制備 將CLEAs用二氧化硅包埋后交聯(lián)到磁珠上可提高穩(wěn)定性[52]。最近,國(guó)內(nèi)有研究者采用無官能修飾的納米Fe3O4制備出了磁性納米交聯(lián)酶聚集體(M-CLEAs),并將其用于微管式反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)了油酸丁酯合成和柴油廢水降解[53]。Nadar[54]等采用果膠作交聯(lián)劑將葡糖淀粉酶固定在3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)上形成磁性納米顆粒。鼠李糖吡喃糖苷酶磁性交聯(lián)酶聚集體(mCLEAs)的開發(fā)在糖類化合物生產(chǎn)中具有重要作用,且在微型填充床生物反應(yīng)器中,mCLEAs最大體積生產(chǎn)力可達(dá)到140 μmol/L·h[55]。此外,磁性CLEA也被用于Combi-CLEAs的制備中并成為當(dāng)下研究的主要熱點(diǎn)之一,因?yàn)榇判訡ombi-CLEAs不僅具備一個(gè)強(qiáng)大的生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng),而且很好的解決了Combi-CLEAs不易復(fù)原的問題,使其成為工業(yè)生物催化工具的新選擇[56]。

5 結(jié)論與展望

CLEAs技術(shù)廣泛應(yīng)用在食品、制藥、化工等領(lǐng)域。其固定化酶具有許多優(yōu)點(diǎn):制備簡(jiǎn)單,優(yōu)化速度快,且能以粗酶為原料而無需純化,CLEAs大都呈現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑的耐受性;同時(shí)該技術(shù)適用于制備含有兩種或多種酶的Combi-CLEAs,可以有利地用于催化級(jí)聯(lián)過程。在微通道反應(yīng)器中使用CLEAs具有明顯的快速篩選和優(yōu)化的潛力。然而,目前大多數(shù)研究仍集中于CLEAs的制備和現(xiàn)象描述,因此,在此基礎(chǔ)上提出以下幾點(diǎn)建議:a.開發(fā)并探究新的交聯(lián)劑,實(shí)現(xiàn)酶活力穩(wěn)定性的進(jìn)一步改善和各種交聯(lián)酶聚集體的開發(fā);b.對(duì)CLEAs技術(shù)影響酶催化效率的深層機(jī)理進(jìn)行探究,實(shí)現(xiàn)從現(xiàn)象描述到深層機(jī)理的研究;c.建立包含各種酶及與之對(duì)應(yīng)的沉淀劑、交聯(lián)劑,添加劑等各因素的數(shù)據(jù)庫,為減少優(yōu)化和精確調(diào)控各因素實(shí)現(xiàn)CLEAs定制提供快速、充分、可靠的技術(shù)平臺(tái)支持。