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(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室,天津 300457)

紫外輻射(ultraviolet radiation,UVR)是太陽輻射的一部分,其輻射能占太陽總輻射的3%～5%。隨著全球氣候的暖化,導(dǎo)致大氣平流層臭氧減少,到達地表的UVR也逐漸增強,這對全球生態(tài)環(huán)境和人類健康產(chǎn)生了重要影響[1-2]。研究表明,過度的UVR會引起機體DNA損傷、誘導(dǎo)細胞凋亡,甚至導(dǎo)致皮膚癌的發(fā)生[3-5]。通常采用減少陽光暴曬、涂抹防曬霜和穿戴防護服等方法以降低UVR導(dǎo)致皮膚癌的發(fā)生。而近年來,從天然產(chǎn)物中篩選具有抗UVR功能的物質(zhì)的研究越來越受到人們的關(guān)注[6-8]。研究表明,水飛薊素(silibinin)、綠茶多酚(green tea polyphenols,GTPs)、紅茶浸提液(black tea infusion)、紅茶茶黃素(black tea extract theaflavins)和表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)等天然產(chǎn)物都具有良好的抗UVR引起的皮膚癌的作用[9-12],而這些物質(zhì)一般都具有抗炎、抗氧化、DNA修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)等生物活性[13-14]。

花生四烯酸(arachidonic acid,AA)是生物體內(nèi)分布最廣泛且具有重要生物活性的一種omega-6多不飽和脂肪酸,具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、降血脂、抗腫瘤和保護皮膚等多種生理活性[15-17]。但目前有關(guān)AA抗UVR的研究尚未見報道。本文通過不同劑量的UVR照射秀麗隱桿線蟲,建立秀麗隱桿線蟲的UVR損傷模型,考察AA對秀麗隱桿線蟲UVR損傷的保護作用,為AA在抗UVR藥品或功能食品中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

N2野生型秀麗隱桿線蟲(雌雄同體) 由北京生命科學(xué)研究所王曉晨研究員惠贈;E.coliOP50:為尿嘧啶合成缺陷性菌株(不含任何抗性) 由CaenorhabditisGeneties Center(University of Minnesota,CGC)惠贈;五氟尿嘧啶(5-Fu) 美國Sigma公司;花生四烯酸(AA純度98%) 武漢歐米嘉生物醫(yī)藥有限公司;瓊脂粉、胰蛋白胨、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙醇等 均為國產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基、NGM培養(yǎng)基、線蟲液體培養(yǎng)(S-Medium)的配制參照張媛[18]的方法。

M9緩沖液:KH2PO43 g,Na2HPO46 g,NaCl 5 g,MgSO40.12 g,加入蒸餾水至1 L,121 ℃高壓滅菌20 min。

LDZH-100KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;HPS-160型生化培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;PXS-104連續(xù)變倍體式顯微鏡 天津市歐諾儀器儀表有限公司;UVC500-230V型紫外交聯(lián)儀 美國Hoefer;TS100型X倒置熒光顯微鏡及照相系統(tǒng) 日本Nikon公司;FE20K型酸度計 梅特勒托利多儀器公司;TGL-18000CR型高速低溫離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;MDF-U33V型-80 ℃冷凍冰箱 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 秀麗隱桿線蟲的基本培養(yǎng) 參照Brenner S[19]、王晉[20]等人的方法,秀麗隱桿線蟲置于涂布有E.coliOP50的標(biāo)準線蟲培養(yǎng)基(NGM)中,20 ℃下培養(yǎng);E.coliOP50采用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 秀麗隱桿線蟲的同期化處理 參照Portadelariva[21]、Wan[22]等人的方法對秀麗隱桿線蟲進行同期化處理。

1.2.3 秀麗隱桿線蟲的UVR處理 將同期化的秀麗隱桿線蟲培養(yǎng)至L4期,收集并用線蟲液體培養(yǎng)基(S-Medium)沖洗蟲體3次,轉(zhuǎn)移至NGM培養(yǎng)板中,保證蟲體無交疊的情況下,在紫外交聯(lián)儀中以不同的劑量(0、2、4、5、6、7、8、10 MJ/cm2)UVR處理30 d。

1.2.4 秀麗隱桿線蟲給藥處理 將UVR處理后的秀麗隱桿線蟲分別挑至涂布有不同濃度AA的NGM培養(yǎng)板中(含有12.5 mg/L的5-Fu),20 ℃下培養(yǎng)24 h。每個濃度作3個平行,空白對照以M9緩沖液進行涂布。

1.2.5 秀麗隱桿線蟲壽命的測定 將1.2.3或1.2.4處理后的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)入涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)板上,20 ℃下培養(yǎng),每組作3個平行,每個平行20條秀麗隱桿線蟲,每天進行觀察并計數(shù)。如用挑針輕觸秀麗隱桿線蟲蟲體,無反應(yīng),即判定線蟲死亡。所有受試秀麗隱桿線蟲從UVR處理或給藥處理后轉(zhuǎn)入NGM培養(yǎng)基上的開始時間記為第0 d。致死率的計算公式如下:

1.2.6 秀麗隱桿線蟲蟲體運動能力的測定 將1.2.4中給藥處理后的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)入涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)板上,20 ℃培養(yǎng)48 h,挑取狀態(tài)相當(dāng)?shù)男沱愲[桿線蟲置于無E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基上,自由運動約2 min后,記錄秀麗隱桿線蟲在20 s內(nèi)蟲體彎曲的次數(shù)作為蟲體運動能力的指標(biāo)。每個濃度作3個平行,每個平行30條秀麗隱桿線蟲,實驗重復(fù)3次。

1.2.7 秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵數(shù)的測定 將15條經(jīng)過給藥處理且生長狀態(tài)相當(dāng)?shù)男沱愲[桿線蟲挑至新的涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)板上,每個NGM培養(yǎng)板上培養(yǎng)1條,每24 h轉(zhuǎn)移1次,直至秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵期結(jié)束。產(chǎn)卵后的培養(yǎng)板20 ℃下培養(yǎng)24 h后記錄子代數(shù)目。每條秀麗隱桿線蟲在產(chǎn)卵期產(chǎn)卵的總和即為該秀麗隱桿線蟲的產(chǎn)卵數(shù)。每個濃度作3個平行,實驗重復(fù)3次。

1.2.8 秀麗隱桿線蟲細胞內(nèi)活性氧(ROS)含量的測定 將1.2.4中給藥處理后的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)入涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)板上,20 ℃培養(yǎng)48 h,用M9緩沖洗滌2次后,轉(zhuǎn)移至含10 μmol 2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′,7′-dichlorodi-hydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)的1 mL M9緩沖液中,20 ℃靜置10 min,瓊脂糖固定秀麗隱桿線蟲,觀察并用熒光顯微鏡拍攝秀麗隱桿線蟲二氯熒光素(DCF)熒光圖像(激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長510 nm)。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用統(tǒng)計學(xué)方法處理數(shù)據(jù),實驗平行重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準差的形式表示,組間差異顯著性用SPSS 13.0軟件經(jīng)t檢驗分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 UVR對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

不同UVR劑量對秀麗隱桿線蟲壽命的影響如圖1所示。由圖1可知,在0～10 MJ/cm2的照射劑量范圍內(nèi),隨著UVR劑量的增加,秀麗隱桿線蟲的致死率也逐步提高,當(dāng)UVR的劑量為10 MJ/cm2時,在第4 d致死率就達到了100%。2、4、5 MJ/cm2處理組與0 MJ/cm2對照組相比,線蟲致死率達到100%所用的時間差異不大;而6、7、8 MJ/cm2處理組所用的時間差異較大,所以選擇中間劑量的UVR,即7 MJ/cm2進行后續(xù)研究。結(jié)果表明,UVR會縮短秀麗隱桿線蟲的壽命,UVR劑量越大,壽命越短。已有研究表明,短時低劑量的UVR會引起機體老化,褶皺增多,但隨著劑量的增加和時間的延長,則會引起生殖細胞凋亡和誘導(dǎo)DNA損傷,進而導(dǎo)致其死亡[23]。這與本文研究的結(jié)果相一致。

圖1 不同UVR劑量對秀麗隱桿線蟲壽命的影響Fig.1 The effect of different doses of UVRon the lifespan of C.elegans

2.2 AA對UVR后的秀麗隱桿線蟲壽命的影響

不同濃度的AA對UVR后秀麗隱桿線蟲壽命的影響如圖2所示。由圖2可知,與空白組(0 μmol/L+7 MJ/cm2)相比,秀麗隱桿線蟲經(jīng)7 MJ/cm2劑量的UVR處理后,經(jīng)不同濃度AA(25～200 μmol/L)干預(yù)之后秀麗隱桿線蟲的致死率均有所降低,其中50 μmol/L的AA降低秀麗隱桿線蟲致死率的效果最好,其次為100、25和200 μmol/L。結(jié)果表明,AA可以延長秀麗隱桿線蟲的壽命,但并不是簡單的濃度依賴性。由于AA及其代謝產(chǎn)物生物化學(xué)性質(zhì)的復(fù)雜性,AA既具有抗氧化、抗腫瘤等生物活性,但也可以通過氧化應(yīng)激、離子通道激活、線粒體損傷等途徑誘導(dǎo)細胞凋亡[24],因此,AA延長秀麗隱桿線蟲壽命的作用機制還有待于進一步深入研究。

圖2 不同濃度AA對UVR后的秀麗隱桿線蟲壽命的影響Fig.2 The effect of different concentrations of AA on the lifespan of C. elegans after UVR

2.3 AA對UVR后的秀麗隱桿蟲運動能力的影響

不同濃度的AA對UVR后秀麗隱桿線蟲運動能力的影響如圖3所示。由圖3可知,7 MJ/cm2劑量UVR處理后的秀麗隱桿線蟲,經(jīng)不同濃度的AA(25～200 μmol/L)干預(yù)之后其運動能力均有所提高。與對照組(0 μmol/L+7 MJ/cm2)相比,50 μmol/L和100 μmol/L AA濃度組秀麗隱桿線蟲的蟲體運動能力極顯著提高(p<0.01)且50 μmol/L時運動能力較0 μmol/L提高了63.6%,25 μmol/L AA濃度組顯著提高(p<0.05),但200 μmol/L AA濃度組卻沒有顯著性差異。結(jié)果表明,AA可以改善UVR處理后的秀麗隱桿線蟲的運動能力,但與AA的濃度不呈正相關(guān),這可能也與AA及其代謝產(chǎn)物生物化學(xué)性質(zhì)的復(fù)雜性有關(guān)。

圖3 AA對UVR后秀麗隱桿線蟲運動能力的影響Fig.3 The effect of AA on the bending frequency of C. elegans after UVR注:與對照組(0 μmol/L+7 MJ/cm2)相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.4 AA對UVR后秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵能力的影響

不同濃度的AA對UVR后秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵能力的影響如圖4所示。由圖4可知,7 MJ/cm2劑量UVR處理后的秀麗隱桿線蟲,經(jīng)25～200 μmol/L濃度范圍的AA干預(yù)之后其產(chǎn)卵數(shù)均有所提高,且隨著AA濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。與對照組(0 μmol/L+7 MJ/cm2)相比,100 μmol/LAA濃度組秀麗隱桿線蟲的產(chǎn)卵數(shù)顯著提高(p<0.05),50 μmol/L AA濃度組極顯著提高(p<0.01),相比0 μmol/L產(chǎn)卵能力提高了96.6%。結(jié)果表明,AA可以增加UVR處理后秀麗隱桿線蟲的產(chǎn)卵數(shù),提高其生殖能力,但與AA濃度也不呈正相關(guān)。

圖4 AA對UVR后秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵數(shù)的影響Fig.4 The effect of AA on the oviposition rate of C. elegans after UVR注:與對照組(0 μmol/L+7) MJ/cm2相比,*p<0.05,**p<0.01。

2.5 AA對UVR后秀麗隱桿線蟲細胞內(nèi)活性氧(ROS)熒光強度的影響

DCF的熒光強度可以反映細胞內(nèi)ROS的水平,熒光越強,細胞內(nèi)ROS的水平就越高。同時,壽命的長短也與細胞內(nèi)ROS水平的高低有著緊密的聯(lián)系,ROS水平越高,某些疾病的發(fā)生的機率也越大[25]。AA對輻射后線蟲體內(nèi)ROS熒光強度的影響如圖5所示。由圖5可以看出,7 MJ/cm2UVR處理組(b組,0 μmol/L+7 MJ/cm2)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的熒光強度最高,其次是50 μmol/L AA給藥組(c組,50 μmol/L+7 MJ/cm2),而空白組(a組,0 μmol/L+0 MJ/cm2)熒光強度最低,因此,秀麗隱桿線蟲細胞內(nèi)活性氧水平b組最高,c組次之,a組最低。這說明秀麗隱桿線蟲經(jīng)URV后,有助于其體內(nèi)的ROS產(chǎn)生。當(dāng)活性氧自由基的數(shù)量超過體內(nèi)抗氧化防御能力時,自由基代謝失衡,并引起細胞損傷[26-27]。同時根據(jù)老齡化的自由基理論,過度的ROS,特別是超氧化物陰離子及其衍生物,會加速其衰老的進程[28]。而AA可以降低UVR后秀麗隱桿線蟲細胞內(nèi)的ROS水平,減緩衰老速度,延長其壽命,從而對UVR損傷的秀麗隱桿線蟲起到修復(fù)作用。

圖5 AA對UVR后秀麗隱桿線蟲體內(nèi)熒光強度的影響Fig.5 Effect of AA on fluorescence intensity of C. elegans after UVR注:a:0 μmol/L+0 MJ/cm2;b:0 μmol/L+7 MJ/cm2; c:50 μmol/L+7 MJ/cm2。

3 結(jié)論

UVR會縮短秀麗隱桿線蟲的壽命,UVR劑量越大,壽命越短;AA能夠提高UVR損傷秀麗隱桿線蟲的壽命、運動和產(chǎn)卵能力,且能降低其體內(nèi)ROS的水平,表明AA對UVR后的秀麗隱桿線蟲具有一定的保護作用;且AA對秀麗隱桿線蟲UVR損傷的保護作用并不是簡單的濃度依賴型,當(dāng)AA濃度為50 μmol/L時,這種保護作用最為明顯,但AA對秀麗隱桿線蟲紫外損傷修復(fù)的作用機理還有待于進一步深入研究。研究結(jié)果為AA在抗UVR藥品或功能食品中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。同時在其今后研究中可以從秀麗隱桿線蟲體內(nèi)細胞信號通路方向及基因水平等方面入手,對AA抗紫外輻射機制進行更加深層次的研究。