郝云慶，羅曉波，王曉玲

(1.成都信息工程大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,四川 成都 610225;2.四川省自然資源科學(xué)研究院,四川 成都 610041；3.峨眉山生物資源實驗站，四川 峨眉山 614201；4.涼山州勞動職業(yè)技術(shù)學(xué)校,四川 西昌 615000)

五小葉槭(Acerpentaphyllum)，是中國四川特有物種，屬于槭樹科，槭屬落葉喬木。根據(jù)IUCN瀕危等級標準(IUCN 1994)，該種已屬于極危物種[1～2]。目前為至，僅在四川省雅江縣米龍鄉(xiāng)[2]，九龍縣三巖龍鄉(xiāng)和呷爾鎮(zhèn)洛莫村[3]，康定縣普沙絨鄉(xiāng)，以及木里縣卡拉鄉(xiāng)5處發(fā)現(xiàn)有分布。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，建立在PCR基礎(chǔ)上的各種分子標記技術(shù)在珍稀瀕危動植物保護中得到越來越廣泛的應(yīng)用[4～6]。分子標記可在分子水平上直接反應(yīng)物種遺傳多樣性[7～9]。RFLP、RAPD、SSR、CAPS和ISSR等是目前常用的分子標記[10～12]。

簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增多態(tài)性(Inter Simple Sequence Repeat，ISSR)是Zietkiewicz等創(chuàng)立的一種新型的分子標記技術(shù)[12]。它綜合了其他分子標記技術(shù)的優(yōu)點，比RFLP、RAPD和SSR反映更豐富的多態(tài)性；ISSR分子標記為顯性標記，穩(wěn)定性較好，無需知道物種SSR背景，一套ISSR引物可以在多個物種中共用，保證PCR擴增反應(yīng)的重復(fù)性[13～16]。因而，ISSR分子標記技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于物種鑒定及分類、親緣關(guān)系鑒定和遺傳多樣性分析當中[17]，從而為探討珍稀瀕危動植物種群的進化機制，預(yù)測小種群未來發(fā)展趨勢起著至關(guān)重要的作用。

確定PCR反應(yīng)最佳的反應(yīng)體系是ISSR分子標記成功與否的關(guān)鍵[18]，能為下一步研究打下良好基礎(chǔ)。目前，大部分反應(yīng)體系通常分別研究Taq酶、Mg、dNTPs、引物和DNA模板共5個因素對反應(yīng)的影響，通常處理多，工作量比較大，分析繁雜。本文中采用目前市面上的PCR反應(yīng)預(yù)裝混合液Master Mix，對Taq酶、dNTPs和Mg2+這3個因素綜合考慮，這樣既可以減少試驗因素，又能獲得較好的試驗結(jié)果[10]。五小葉槭ISSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化目前尚屬研究空白，本研究旨在從DNA模板、引物和Master Mix共3個因素優(yōu)化五小葉槭ISSR-PCR反應(yīng)體系，為進一步對五小葉槭種群遺傳多樣性分析和保護遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

分別在雅江縣米龍鄉(xiāng)，九龍縣三巖龍鄉(xiāng)和呷爾鎮(zhèn)洛莫村，康定縣普沙絨鄉(xiāng)，以及木里縣卡拉鄉(xiāng)5處五小葉槭居群采集葉片組織樣品(各樣本間距離>20 m)，不同植株隨機選擇3～5片無病蟲害新鮮幼嫩葉片，硅膠快速干燥保存?zhèn)溆?。提取五小葉槭基因組DNA試劑盒，以及用于ISSR-PCR反應(yīng)的2x Master PCR Mix，DL2000 Marker和ISSR引物均購置于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司(www.tsingke.net)。所選用的ISSR引物根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)(UBC)公布的第9套ISSR引物序列進行初步篩選，選擇UBC807(AGA GAG AGA GAG AGA GT)正交實驗引物固定引物，UBC809(AGA GAG AGA GAG AGA GG)作為最佳反應(yīng)條件驗證引物。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取和檢測

采集的五小葉槭葉片選用北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA的提取，操作步驟按照試劑盒說明書進行。配制0.8%的瓊脂糖凝膠進行五小葉槭基因組DNA完整性和濃度的檢測。將DNA模板濃度統(tǒng)一稀釋至50 ng/μL，將稀釋好的DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ISSR-PCR各反應(yīng)因素的確定

試驗采用2X Master PCR Mix，里面包含有dNTPS，Mg2+以及Taq酶，減少了反應(yīng)影響因素，可以較好的控制實驗，對試驗進行綜合評價。對影響ISSR-PCR反應(yīng)的3個因素(DNA模板，引物和Mix)，按照L9(33)三因素三水平進行正交實驗(見表1)。

表1 五小葉槭ISSR-PCR反應(yīng)體系各因素水平Tab.1 The levels and factors of ISSR-PCR reaction system

1.2.3 ISSR-PCR擴增測序及擴增產(chǎn)物檢測

PCR反應(yīng)采用25 μL擴增體系，各反應(yīng)如表2所示，用ddH2O補足25 μL。 PCR擴增程序為： 94℃預(yù)變性5 min， 94 ℃變性30 s， 52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min30 s，35個循環(huán)，72 ℃總延伸5 min，8 ℃保存。取10 μLPCR擴增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

表2 PCR反應(yīng)因素水平的L9(33)正交設(shè)計方案Tab.2 L9(33) orthogonal design for different factors and levels of PCR reaction

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果檢測

本次實驗一次性同時提取6份不同個體五小葉槭葉片DNA。電泳結(jié)果顯示，提取DNA效果較好，點樣孔干凈，無蛋白污染，條帶清晰單一，濃度較高，無明顯降解，比較完整(見圖1)。

2.2 ISSR-PCR擴增產(chǎn)物檢測及評分

按照表正交設(shè)計的9個處理進行PCR擴增，為了減少試驗誤差，每個處理設(shè)置3個重復(fù)。從瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果看出9個反應(yīng)均出現(xiàn)擴增條帶(見圖2)。根據(jù)電泳結(jié)果，將9個處理從高到低依次打分(見表3)。條帶清晰度高、數(shù)量豐富、背景干擾低的最優(yōu)產(chǎn)物記為9分，而最差產(chǎn)物記為1分，3個重復(fù)分別獨立統(tǒng)計。

圖1 DNA提取電泳圖 M為DL2000 Marker，1～6為份不同個體五小葉槭葉片DNAFig.1 The extraction of template DNA

圖2 ISSR-PCR反應(yīng)擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖 A，B，C為3個重復(fù)結(jié)果，1～9為表2中對應(yīng)的9個處理，M為DL2000 MarkerFig.2 ISSR-PCR reaction effect of agarose gel electrophoresis.A,B,C mean three repeats

表3 正交設(shè)計中9個處理綜合評分結(jié)果Tab.3 Scores of 9 treatments in orthogonal

2.3 各因素之間對五小葉槭ISSR-PCR反應(yīng)影響差異分析

上述各處理評分結(jié)果利用DPS 7.05統(tǒng)計軟件進行方差分析(見表4)。從F值可以看出，引物濃度對五小葉槭ISSR-PCR反應(yīng)影響最大，其次為模板DNA濃度。各因素水平變化對ISSR-PCR反應(yīng)影響順序為：引物>DNA模板>Master Mix。并且各因素水平間的差異均達到極顯著水平，因而可以更進一步對各因素內(nèi)進行多重比較分析。

表4 五小葉槭ISSR-PCR反應(yīng)各因素間方差分析Tab.4 Analysis of variance among factors

2.4 因素內(nèi)各水平對五小葉槭ISSR-PCR擴增結(jié)果的影響

為了獲得各水平最優(yōu)的反應(yīng)條件，對各因素內(nèi)進行多重比較分析。由F值可知，引物濃度為3個優(yōu)化因素中對PCR反應(yīng)影響最大的。在25μL反應(yīng)體系中，引物濃度為0.4 μmol·L-1、0.8 μmol·L-1、1.2 μmol·L-13個水平間差異達到極顯著水平，在引物濃度為0.8 μmol·L-1水平時表現(xiàn)最好。因此，確定引物濃度為0.8 μmol·L-1作為最佳反應(yīng)引物濃度。

DNA模板濃度在影響五小葉槭ISSR-PCR反應(yīng)的因素中處于第2位。在25 μL反應(yīng)體系中，DNA模板為50 ng、100 ng、150 ng這3個水平間差異達到極顯著，且隨著模板量增加，反應(yīng)平均得分降低。由此，選擇50 ng的DNA模板用量作為最佳水平。

雖然根據(jù)方差分析，Master Mix用量對PCR反應(yīng)結(jié)果影響最小，但是根據(jù)25 μL反應(yīng)體系中，Master Mix用量為13.5 μL時得分最高。因而，選用13.5 μL作為Master Mix的最佳用量(見圖3)。

圖3 因素內(nèi)各水平間與評分均值關(guān)系Fig.3 The relationship between the levels of the factors and the mean score

2.5 對最佳反應(yīng)體系的驗證

用ISSR引物UBC809對6份不同個體的五小葉槭進行反應(yīng)最佳體系驗證，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴增條帶清晰，重復(fù)性好。上述最佳反應(yīng)體系可進行下一步五小葉槭群體遺傳多樣性研究(見圖4)。

圖4 ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系驗證結(jié)果M為DL2000 Marker，1～6為引物UBC809擴增6份不同五小葉槭DNA模板電泳結(jié)果Fig.4 The verification results of the optimized ISSR-PCR system

3 結(jié)論與討論

ISSR分子標記技術(shù)是基于PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的分子標記技術(shù)，目前通常以DNA模板、引物濃度、Mg2+、dNTPs以及taq酶為主要因素研究其對PCR反應(yīng)的影響，并確定最佳適合研究材料的反應(yīng)體系[19～20]。利用2X Master Mix將Mg2+、dNTPs以及taq酶這3個因素進行綜合考慮，進行ISSR-PCR試驗還未見有人報道。本試驗采用2X Master Mix，減少試驗誤差，提高效率，增強穩(wěn)定性。采用正交設(shè)計的方法，對影響PCR反應(yīng)的DNA模板、引物和Master Mix共3個因素進行優(yōu)化，通過DPS統(tǒng)計軟件分析結(jié)果表明各因素水平變化對ISSR-PCR反應(yīng)影響順序為：引物>DNA模板>Master Mix，并最終確立五小葉槭ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系(25 μL)為1 μLDNA模板(50 ng·μL-1)、2 μL引物(10 μM)和13.5 μL Master Mix。同時通過最佳體系驗證試驗，結(jié)果穩(wěn)定，條帶清晰。這就為應(yīng)用ISSR分子標記技術(shù)進行五小葉槭的遺傳多樣性研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

結(jié)果表明，五小葉槭種群間基因分化系數(shù)Gst為0.3722，遠遠高于Hamrick和Godt(1989)統(tǒng)計的長壽命木本植物Gst平均值(0.073)，這說明五小葉槭種群起源較為古老，種間分化已達到了較高的水平。

五小葉槭屬于雅礱江中游干旱河谷地區(qū)的特有物種，對干旱河谷環(huán)境的適生性普遍優(yōu)于其它物種，因此，這樣的特化也使它的分布僅局限于這一狹窄的區(qū)域。可見，五小葉槭的致危因素并不是來自于其它物種種間競爭的壓力。在實地調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)，五小葉槭種群不會形成單一優(yōu)勢種的群落結(jié)構(gòu)，而是與多種物種呈共優(yōu)的局面；所以，五小葉槭群落的保育也不必追求單一優(yōu)勢種的群落結(jié)構(gòu)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，五小葉槭的結(jié)實能力較強，種子散落后也能完成自然萌發(fā)，只是因旱季水分虧缺當年實生苗很難越冬存活。這是其自身生物學(xué)特性所致，與其它物種的競爭沒有直接相關(guān)。