周正雄，王兵兵，胥睿睿，李青，堵國成，康振

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肝素硫酸轉移酶優(yōu)化表達及其在動物源肝素硫酸化中的應用

周正雄1,2，王兵兵1,2，胥睿睿1,2，李青1,2，堵國成1,2，康振1,2

1 江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇，無錫 214122 2 江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122

周正雄, 王兵兵, 胥睿睿, 等. 肝素硫酸轉移酶優(yōu)化表達及其在動物源肝素硫酸化中的應用. 生物工程學報, 2018, 34(11): 1784–1793.Zhou ZX, Wang BB, Xu RR, et al. Optimized expression of heparin sulfotransferases and their application in sulfation of animal derived heparin. Chin J Biotech, 2018, 34(11): 1784–1793.

肝素是一種重要的凝血藥物，目前主要依賴于動物小腸粘膜的提取。動物源肝素含有的抗凝血活性五糖單位GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S3S-Ido2S-GlcNS6S少，抗凝血活性低下。文中提出并驗證了一種基于酶法催化動物源肝素，提高其硫酸化程度和抗凝血活性的方法。通過比較3種硫酸轉移酶肝素-2-硫酸轉移酶 (Heparan sulfate-2-O-sulfotransferase，HS2ST)、肝素-6-硫酸轉移酶 (Heparan sulfate-6-O- sulfotransferase，HS6ST)、肝素-3-硫酸轉移酶 (Heparan sulfate-3-O-sulfotransferase，HS3ST) 在重組大腸桿菌及重組畢赤酵母中表達，確定了畢赤酵母作為3種硫酸轉移酶的表達宿主；進一步通過N端融合麥芽糖融合蛋白MBP和硫氧還蛋白TrxA，HS2ST和HS6ST的酶表達水平分別提高至 (839±14) U/L和 (792±23) U/L。通過3種硫酸轉移酶HS2ST、HS6ST和HS3ST共同催化動物源肝素，其抗凝血活性由 (76±2) IU/mg提高至 (189±17) IU/mg。

肝素，抗凝血活性，硫酸轉移酶，畢赤酵母，異源表達

肝素是一類由葡萄糖醛酸 (Glucuronic acid, GlcUA) 和N-乙酰氨基葡萄糖 (N-Acetyl-D- glucosamine，GlcNAc) 經(jīng)b-1,4和a-1,4糖苷鍵交替連接，并經(jīng)一定程度的硫酸化修飾而成的粘多糖[1-2]。它廣泛存在于細胞表面，在細胞識別、信號傳遞、組織發(fā)育過程中起重要的作用[3-4]。肝素的五糖結構GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S3S-Ido2S- GlcNS6S能與絲氨酸蛋白酶抑制劑Antithrombin (AT) 結合、改變AT的結構并調(diào)控血液凝結，因此，在臨床上肝素被用作手術后的抗凝血藥物 (圖1)[5-6]。

目前臨床上使用的肝素多為從豬小腸等動物腸黏膜中提取得到。而超過2/3的動物來源的肝素活性單位 (小于20 USP U/mg) 遠低于醫(yī)藥級肝素活性單位的要求 (120–180 U/mg)[7]。這是由于抗凝血活性特征結構單元占總結構單元的比例僅為10%左右[8]，部分結構未被硫酸化或硫酸化程度偏低。單位質(zhì)量的抗凝血活性較低導致臨床使用過程中大量添加肝素容易誘導血小板減少、術后出血等并發(fā)癥[9-10]。因此，提高肝素的硫酸化修飾程度可以降低使用劑量和感染并發(fā)癥的風險。

以往研究往往關注于動物源肝素的組成、異源表達肝素合成的各種磺酸轉移酶和變構酶以及這些酶催化反應機制。僅有陳敬華、陳萌、Fu等[11-13]證明通過異源表達的肝素3-O-硫酸轉移酶可以修飾動物源肝素并提高其抗凝血活性。

為了進一步提高動物源肝素的硫酸化程度以及抗凝血活性，本研究在對動物源肝素二糖結構進行分析的基礎上[14]，通過優(yōu)化肝素-2-硫酸轉移酶 (Heparan sulfate 2-O-sulfotransferase，HS2ST)，肝素-6-硫酸轉移酶(Heparan sulfate 6-O- sulfotransferase，HS6ST)，肝素-3-硫酸轉移酶 (Heparan sulfate 3-O-sulfotransferase, HS3ST) 3種硫酸轉移酶，建立了體外酶法催化動物源肝素，提高其抗凝血活性的策略。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

本實驗所有的質(zhì)粒構建都在JM109中進行，大腸桿菌重組菌株構建的出發(fā)菌株為.BL21，畢赤酵母重組菌株構建的出發(fā)菌株為GS115，詳情見表1。

1.2 菌株構建

將密碼子優(yōu)化后的雞來源HS2ST (NP_989812.1)、HS6ST (NP_989813.1) 及老鼠來源HS3ST (NP_034604.1) 經(jīng)PCR擴增后 (所用引物見表2)，酶切連接至pET28a建重組載體pET28a- HS2ST、pET28a-HS6ST和pET28a-HS3ST。將來源于大腸桿菌的促融標簽麥芽糖融合蛋白(Maltose binding protein，MBP) 基因經(jīng)PCR擴增后一步克隆至pET28a-HS2ST、pET28a-HS6ST構建重組質(zhì)粒pET28a-MBP-HS2ST和pET28a-MBP- HS6ST。

圖1 肝素的抗凝血機理

將密碼子優(yōu)化后的雞來源HS2ST、HS6ST及老鼠來源HS3ST經(jīng)PCR擴增后，酶切連接至pPIC9k構建重組載體pPIC9K-HS2ST、pPIC9K- HS6ST和pPIC9K-HS3ST。將來源于大腸桿菌的MBP及促進二硫鍵形成的硫氧還蛋白 (TrxA) 基因經(jīng)PCR擴增后，一步克隆至pPIC9K-HS2ST和pPIC9K-HS6ST構建重組質(zhì)粒pPIC9K-MBP- TrxA-HS2ST和pPIC9K-MBP-TrxA -HS6ST。

將pET系列的重組質(zhì)粒42 ℃熱激90 s轉化.BL21構建硫酸轉移酶的重組大腸桿菌.BL21-pET28A-HS2ST、.BL21-pET28A- HS6ST、.BL21-pET28A-HS3ST、.BL21- pET28A-MBP-HS2ST及.BL21-pET28A- MBP-HS6ST等。

將pPIC9K系列的重組質(zhì)粒經(jīng)Ⅰ酶切線性化后1 500 V電轉.GS115構建硫酸轉移酶的重組畢赤酵母.GS115-pPIC9K- HS2ST、.GS115-pPIC9K-HS6ST、.GS115-pPIC9K-HS3ST、.GS115-pPIC9K-MBP-TrxA-HS2ST及.GS115-pPIC9K-MBP-TrxA-HS6ST。

1.3 培養(yǎng)基組分

LB培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉10，蛋白胨5，NaCl 5，用于大腸桿菌的培養(yǎng)；TB培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉24，蛋白胨12，甘油4 mL，KH2PO42.31，K2HPO412.54，用于大腸桿菌工程菌株的培養(yǎng)；YPD培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，用于畢赤酵母的培養(yǎng)；MD培養(yǎng)基 (g/L)：瓊脂20，YNB 13.4，生物素4×10–4，葡萄糖20，用于重組畢赤酵母轉化子的篩選；BMGY培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，K2HPO43，KH2PO411.8，YNB 13.4，生物素4×10–4，甘油10 mL，用于重組畢赤酵母的種子培養(yǎng)；BMMY培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，K2HPO43，KH2PO411.8，YNB 13.4，生物素4×10–4，甲醇5 mL，用于重組畢赤酵母的誘導培養(yǎng)。同時在培養(yǎng)基中根據(jù)質(zhì)粒的抗性需要添加一定濃度的抗生素：氨芐青霉素100 mg/L，卡那霉素50 mg/L，遺傳霉素4 mg/mL等。

表1 本文所用質(zhì)粒和菌株

1.4 重組菌株培養(yǎng)

1.4.1 重組大腸桿菌的培養(yǎng)

挑取單菌落接種于50 mg/L卡那霉素的3 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。按1% (/)接種于新鮮的50 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至600為0.6?1.0，添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，30 ℃培養(yǎng)6 h誘導重組蛋白的表達。

1.4.2 重組畢赤酵母的培養(yǎng)

重組畢赤酵母的培養(yǎng)參考畢赤酵母分泌表達手冊 (AVector for Multicopy Integration and Secreted Expression，Invitrogen)。

1.5 硫酸轉移酶粗酶液制備

對于在大腸桿菌中進行胞內(nèi)表達的重組硫酸轉移酶的粗酶液獲取主要由以下步驟組成：1) 離心5 min收集菌體 (8 000×，4 ℃)；2) 20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4) 洗滌菌體2次；3) 20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4) 重懸菌體至600=20；4) 高壓勻漿破碎細胞 (800 bar，5 min)；5) 12 000×離心20 min收集上清備測酶活及純化。

表2 本文所用引物

Underlines represent the restriction site.

對于在畢赤酵母中進行分泌表達的重組硫酸轉移酶的粗酶液獲?。? 000×、4 ℃離心10 min收集上清即為粗酶液。

1.6 重組蛋白的親和純化

首先用25 mL溶液A (20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑) 平衡Ni-NTA柱后上樣過0.22mm的粗酶液，分別用10%、40%、100%的溶液B (20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑) 進行洗脫并收集相應的洗脫液。并對得到的洗脫液進行脫鹽處理，所用脫鹽緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)，脫鹽柱為G10。

1.7 硫酸轉移酶酶活測定

硫酸轉移酶酶活測定采用分光光度計檢測對硝基苯酚的生成量[15-16]。標準反應條件為900mL的底物母液 (50 mmol/L PNPS, 0.5 mmol/L 3?,5?-二磷酸腺苷, 0.5 mg ASST IV和10 mg肝素溶解在20 mmol/L Tris-HCl (pH7.4) 中)，37 ℃預熱5 min后加入100mL 1 g/L的硫酸轉移酶液，37 ℃反應1 h后加入0.2 mL 10 mol/L氫氧化鈉溶液終止反應。12 000×離心10 min后去除沉淀，400 nm下測定酶聯(lián)反應產(chǎn)生的對硝基苯酚的吸光值。一個硫酸轉移酶的活性單位定義為在pH 7.4、37 ℃條件下，每小時釋放1mmol/L對硝基苯酚所需要的酶量。對照反應為相同條件下加入等量已滅活的酶液。每個反應均做3個生物學重復，取平均值為最終的酶活值。

1.8 酶法修飾肝素

在1 mL底物母液中，單獨或共同加入300mg硫酸轉移酶，37 ℃反應48 h后加入100mL 10 mol/L NaOH終止反應。

1.9 肝素二糖結構鑒定

取100mL的酶法修飾液，加入10mL 4 U/mL的肝素裂解酶Ⅰ和4 U/mL的肝素裂解酶Ⅲ，37 ℃反應至232吸光值不再增加，12 000×離心 20 min收集上清備測LC-TOF-MS[17]。LC洗脫條件為60 min內(nèi)甲醇濃度由0上升線性至40%。MS條件為在負離子模式下進行100–900/掃描，其中氮氣為載氣。

1.10 肝素抗凝血活性測定

肝素效價的測定方法參考中國藥典《1208肝素生物測定法》APTT法[18]：取血漿50mL加入酶法修飾肝素反應液50mL，混合均勻，加入APTT試劑50mL，37 ℃預熱3 min，加入50mL 25 mmol/L CaCl2后立即用血液凝固分析儀測定凝結時間。每個反應均做3個生物學重復，取平均值為最終的肝素效價。

2 結果與分析

2.1 硫酸轉移酶的表達

為了研究不同宿主對硫酸轉移酶表達的影響，原核表達宿主.BL21和真核表達宿主.GS115作為兩個代表性宿主表達來源于雞和老鼠的硫酸轉移酶。

以.BL21為表達宿主時，重組蛋白HS2ST、HS6ST在誘導性啟動子T7的誘導下均以包涵體的形式存在 (圖2A、2B)。在兩種硫酸轉移酶的N端融合促融標簽MBP后，在重組胞內(nèi)上清中有明顯條帶 (圖2C、2D)，此結果與文獻報道一致[19-20]，表明融合表達MBP有助于動物源基因在微生物細胞中的可溶表達。重組蛋白HS3ST在誘導性啟動子T7的誘導下有清晰的可溶表達條帶 (圖2D)。

以.GS115為表達宿主時，對3種硫酸轉移酶進行分泌表達。在誘導性啟動子AOX作用下，重組.胞外未見到符合HS2ST、HS6ST大小的條帶 (結果未展示)，這一點與在乳酸克魯維酵母中表達硫酸轉移酶結果較為一致[19]。鑒于在重組.中融合MBP提高上述兩種硫酸轉移酶的可溶表達，在.中異源表達上述兩種蛋白時也在N端融合MBP，得到了清晰的條帶 (結果未展示)。同時，根據(jù)在線預測網(wǎng)站http://disulfind.dsi.unifi.it/預測上述兩種硫酸轉移酶的二級結構表明分別存在2對、6對二硫鍵。因此在MBP的C端、硫酸轉移酶的N端融合TrxA促進二硫鍵的形成[21]。由此在重組.胞外發(fā)酵液上清中見到符合MBP-TrxA-HS2ST (87 kDa)、MBP-TrxA-HS6ST (97 kDa) 大小的條帶 (圖2E)。重組蛋白HS3ST在重組.中，以AOX為啟動子時成功地實現(xiàn)了胞外的分泌表達 (圖2F)。

對于不容易電離的待測生物大分子蛋白，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜 (Matrix- assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS) 鑒定上述條帶均為目的條帶。

圖2 硫酸轉移酶異源表達蛋白膠圖

2.2 硫酸轉移酶酶活測定

以重組.胞內(nèi)可溶表達得到的MBP- HS2ST、MBP-HS6ST及HS3ST和重組.胞外分泌表達得到的MBP-HS2ST、MBP-HS6ST、HS3ST及MBP-TrxA-HS2ST、MBP-TrxA-HS6ST進行硫酸轉移酶活性測定。以肝素為底物，通過偶聯(lián)酰基磺酸轉移酶ASSTIV，在此過程中生成的顯色物質(zhì)作為硫酸轉移酶活性定量指標。 其中HS2ST催化IdoA 2號位羥基硫酸化形 成Ido2S，HS6ST催化GlcNS 6號位羥基硫酸 化形成GlcNS6S，HS3ST催化GlcNS6S形成GlcNS6S3S，從而形成抗凝血活性的核心五糖結構GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S3S-Ido2S-GlcNS6S。由圖3A可見重組.分泌表達的MBP- HS2ST、MBP-HS6ST、HS3ST粗酶液酶活明顯高于重組.胞內(nèi)表達的上述重組蛋白的酶活，分別達到了 (321±13) U/L、(270±8) U/L、(749±26) U/L。這也說明真核細胞更易于表達得到高活性的 硫酸轉移酶，與在.中異源表達得到的 硫酸轉移酶活性高于.中異源表達得到 的硫酸轉移酶酶活的結論一致[19]。因此后續(xù)針 對重組蛋白的改造都集中在重組.中 進行。

以N端融合伴侶分子TrxA的重組.MBP-TrxA-HS2ST、.MBP-TrxA-HS6ST的胞外上清粗酶進行催化反應得到上述兩種粗酶液的酶活分別是 (839±14) U/L和(792±23) U/L，比沒有融合TrxA的重組.胞外上清粗酶液酶活高 (圖3B)。因此，幾種硫酸轉移酶共同催化肝素磺酸化修飾時采用重組.分泌表達的MBP-TrxA-HS2ST (比酶活 (20 975±350) U/mg)、MBP-TrxA-HS6ST (比酶活 (4 400±128) U/mg) 及HS3ST (比酶活 (489±17) U/mg)。上述硫酸轉移酶在.中異源表達得到的比酶活也大于在.中異源表達得到比酶活[19]。

2.3 肝素結構鑒定

經(jīng)硫酸轉移酶催化后的反應液通過陰離子交換樹脂DEAE純化后得到肝素改性樣品。肝素裂解酶Ⅰ、Ⅲ共同作用于肝素改性樣品得到分子量小于2 000 Da的肝素二糖。鑒于肝素二糖在中性及弱堿性條件下帶負電荷，因此通過LC-TOF-MS的負離子模式對得到的二糖結構及含量進行鑒定和計算 (圖4)。

經(jīng)MBP-TrxA-HS2ST催化肝素后，DU2S- GlNS提高了36%至占總二糖結構的16.3%，經(jīng)MBP-TrxA-HS6ST催化肝素后DU2S-GlNS6S提高了7%至占總二糖結構的62.0%，經(jīng)HS3ST催化肝素后，DU2S-GlNS6S3S提高了115%至占總二糖結構的36.6%。MBP-TrxA-HS6ST和HS3ST共同催化肝素時，DU2S-GlNS6S3S提高了121%至占總二糖結構的37.6%；MBP-TrxA-HS2ST、MBP-TrxA- HS6ST和HS3ST等3個硫酸化酶共同催化肝素時，DU2S-GlNS6S3S提高了123%占總二糖結構的37.9%。

圖3 不同宿主異源表達硫酸轉移酶的酶活差異

圖4 肝素二糖結構解析

2.4 肝素抗凝血活性測定

來源于動物腸黏膜組織提取的肝素經(jīng)3種硫酸化酶催化改性后，由APTT法測定其抗凝血活性。結果表明通過HS3ST催化后，肝素抗凝血活性由 (76±2) IU/mg提高至 (140±8) IU/mg，高于2017年Fu等[13]利用HS3ST催化牛小腸來源肝素提高肝素抗凝血活性至105 IU/mg；經(jīng)MBP-TrxA- HS6ST及HS3ST催化后的肝素抗凝血活性達到(167±12) IU/mg；由MBP-TrxA-HS2ST、MBP- TrxA-HS6ST及HS3ST共同催化的肝素抗凝血活性最高達到 (189±17) IU/mg，近似國標及美國標準的肝素使用標準180 IU/mg (圖5)。

圖5 酶法修飾對肝素抗凝血活性的影響

3 結論

通過分析動物源肝素的二糖結構，我們證明了動物源肝素中大量糖殘基未被硫酸化，導致其抗凝血活性低。本研究中，通過優(yōu)化雞HS2ST、HS6ST和老鼠HS3ST在重組.GS115中的異源表達，建立了酶法催化動物源肝素硫酸化的策略。通過重組HS2ST、HS6ST和HS3ST催化后，動物源肝素的抗凝血活性提高至 (189±17) IU/mg，達到臨床使用標準?；贖S2ST、HS6ST和HS3ST多酶催化動物源肝素的策略為修飾動物源肝素提高其抗凝血活性提供了一條有效路徑。

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Optimized expression of heparin sulfotransferases and their application in sulfation of animal derived heparin

Zhengxiong Zhou1,2, Bingbing Wang1,2, Ruirui Xu1,2, Qing Li1,2, Guocheng Du1,2, and Zhen Kang1,2

1 Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China 2School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China

Heparin is a very important anticoagulant drug. Currently, heparin is mainly extracted from porcine mucosa. However, animal-derived heparin shows low anticoagulant activity due to the low proportion of the anticoagulant active unit, the GlcNS6S-GlcA-GlcNS6S3S-Ido2S-GlcNS6S pentasaccharide. In this study we proposed an enzymatic strategy to sulfate the animal-sourced heparin to increase the proportion of anticoagulant pentasaccharide and the anticoagulant activity. First, three sulfotransferases HS2ST, HS6ST, and HS3ST were expressed tentatively inand. After measuring the sulfotransferase activity, we confirmed.GS115 is the better host for sulfotransferases production. Then, the maltose binding protein (MBP) and thioredoxin (TrxA) were fused separately to the N-terminal of sulfotransferases to increase enzyme solubility. As a result, the yields of HS2ST and HS6ST were increased to (839±14) U/L and (792±23) U/L, respectively. Subsequent sulfation of the animal-sourced heparin with the recombinant HS2ST, HS6ST and HS3ST increased the anticoagulant activity from (76±2) IU/mg to (189±17) IU/mg.

heparin, anticoagulant activity, sulfotransferase,, heterologous expression

July 2, 2018;

September 6, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31670092), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. 1012050205181370).

Zhen Kang. Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918309; E-mail: zkang@jiangnan.edu.cn

Guocheng Du. Tel: +86-510-85918307; Fax: +86-510-85918309; E-mail: gcdu@jiangnan.edu.cn

10.13345/j.cjb.180277

國家自然科學基金(No. 31670092)，江南大學自主科研計劃重點項目基金(No. 1012050205181370) 資助。

2018-10-15

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20181009.1318.001.html

(本文責編 陳宏宇)