王亞林，仇華吉，孫元

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皰疹病毒的示蹤技術：看到了什么？還能看到什么？

王亞林，仇華吉，孫元

中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150069

王亞林, 仇華吉, 孫元. 皰疹病毒的示蹤技術：看到了什么？還能看到什么？生物工程學報, 2018, 34(11): 1721–1733.Wang YL, Qiu HJ, Sun Y. Tracking of herpesviruses: what have been seen and will be seen? Chin J Biotech, 2018, 34(11): 1721–1733.

病毒感染宿主細胞是一個非常復雜的過程，涉及病毒與多種宿主成分的相互作用。目前通過可視化病毒示蹤技術可對病毒復制周期的各個過程進行實時、原位觀察。皰疹病毒是一類有囊膜的DNA病毒，在自然界中廣泛存在，對人類和動物健康構成嚴重威脅。文中綜述了病毒示蹤技術在皰疹病毒研究中的應用。這些研究為認識皰疹病毒的感染、復制機制以及病毒與宿主相互作用的過程開拓了新的視野。但該技術還不是十分完善，包括標記物最佳插入位點的選擇、無法示蹤病毒生命周期的全過程等。相信隨著相關技術的發(fā)展與進步，會實現(xiàn)對皰疹病毒復制周期更加詳細地追蹤，從而更為詳盡地揭示其復制機制。

病毒示蹤技術，皰疹病毒，熒光蛋白，復制，潛伏感染，軸突轉運

病毒是在普通光學顯微鏡下不可見的依賴活細胞寄生的微生物。病毒廣泛存在，可以感染自然界已知的所有生命體。許多病毒能造成人類的嚴重疾病，如近年來的SARS-CoV、H5N1亞型高致病性禽流感病毒、H1N1甲型流感病毒等曾大規(guī)模流行，造成全球恐慌。因此，人類必須加強病毒學研究，尋找攻克病毒病的方法，這就必須深入探究病毒感染宿主的詳細機制。傳統(tǒng)的研究方法無法直觀地研究病毒在活細胞內的感染行為，但是在給病毒標記上熒光標簽之后，就能使病毒的感染過程可視化，即病毒示蹤技術。

示蹤技術是利用放射性或非放射性的標記物在體內或體外跟蹤其行徑、轉變和代謝等過程的技術。而病毒示蹤技術，即利用標記物標記病毒，從而追蹤其在細胞或宿主體內的復制、擴散等生命活動的示蹤技術。而這一技術更是得益于綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein，GFP) 的發(fā)現(xiàn)和應用。隨著基因工程技術的發(fā)展和其他熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)與改造，科學家們研發(fā)了多種新型的病毒示蹤策略，為生物醫(yī)學研究作出了巨大貢獻。

病毒示蹤技術實現(xiàn)了病毒感染的可視化，即“看得見”的病毒感染。這使得人類對病毒感染的微觀世界有了更加直觀的認識。病毒感染宿主細胞是一個非常復雜的過程，包含黏附、入侵、復制、包裝以及釋放等多個步驟，而且還涉及病毒與細胞內多種組分的復雜相互作用。傳統(tǒng)的技術無法直觀地研究活細胞中的病毒感染過程。而病毒示蹤技術能夠實時、原位地研究病毒在活細胞內的感染行為[1-2]。

1 皰疹病毒的示蹤技術

皰疹病毒是一類有囊膜的DNA病毒，分為α皰疹病毒、β皰疹病毒、γ皰疹病毒以及其他皰疹病毒。其中有代表性的α皰疹病毒包括能夠感染人類的單純皰疹病毒 (Herpes simplex virus type 1/2，HSV-1/2)、水痘帶狀皰疹病毒 (Varicella-zoster virus，VZV) 以及感染動物的偽狂犬病病毒 (Pseudorabies virus，PRV)、雞馬立克氏病病毒 (Marek’s disease virus，MDV) 等。β皰疹病毒主要有人類的巨細胞病毒 (Human cytomegalovirus，HCMV)[3]。病毒示蹤技術很早就已經(jīng)應用于皰疹病毒的研究當中，隨著示蹤技術的發(fā)展和高敏感度熒光蛋白的衍生，多種熒光蛋白已經(jīng)用于標記皰疹病毒，從而研究皰疹病毒的復制周期及其與宿主細胞的相互作用。

病毒示蹤劑的標記方法繁多，主要包括基因工程技術標記、化學反應法標記以及細胞結構標記等[1,4-5]。相應的病毒示蹤劑包括熒光蛋白、肽/蛋白標簽、有機染料、量子點以及熒光素酶等，這些標記方法和示蹤劑同樣適用于皰疹病毒的示蹤。

自20世紀60年代初發(fā)現(xiàn)GFP以來，熒光蛋白在生命科學和醫(yī)學研究中獲得了廣泛應用。研究者利用基因工程技術構建了一系列能夠表達熒光蛋白的生物有機體，包括病毒、細菌、酵母、寄生蟲以及轉基因動植物等，然后通過光學成像技術可以直接觀察到從微觀到宏觀各個層次上豐富多彩的生命現(xiàn)象[6]。肽/蛋白標簽多為人工改造的多肽或酶，其本身不具有熒光特性，但可通過與熒光標記的特異性識別分子或底物之間的化學反應實現(xiàn)對肽/蛋白標簽目的蛋白的標記[7-8]。這一類的病毒示蹤劑有HaloTag蛋白標簽以及利用脊髓灰質炎病毒等腸道病毒非結構蛋白2C構建的一系列Flag-2C肽標簽等[2,9]。有機熒光染料大多是含有共軛雙鍵、苯環(huán)的小分子化合物，具有分子量小、種類繁多等特點，現(xiàn)已廣泛應用于熒光成像領域。如利用Cy5染料標記腺病毒衣殼，闡明了其感染機制[10]。DiO是一種脂質染料，可標記病毒包膜，通過觀測熒光強度的變化研究病毒的感染過程[11]。量子點 (Quantum dot，QD) 是一種新型納米材料，具有熒光強度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛用于活細胞標記、免疫標記及活體成像等研究領域。Li等通過共價結合將量子點嵌入人類免疫缺陷病毒1型 (Human immunodeficiency virus type 1，HIV-1) 的衣殼內，利用單顆粒示蹤技術揭示了HIV-1是通過內吞的方式入侵巨噬細胞的[1]。熒光素酶是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的總稱，通過與相應底物發(fā)生氧化反應而產(chǎn)生生物冷光[12]，包括最常用的螢火蟲熒光素酶 (Firefly luciferase)、海腎熒光素酶 (luciferase)、熒光素酶以及NanoLuc熒光素酶等[12-15]。利用熒光素酶標記的病毒感染動物或細胞后，可通過注射或加入底物的方式實現(xiàn)對病毒感染的體內外示蹤，已在病毒感染的相關研究中獲得了廣泛應用[16-18]。圖1展示了熒光標記物在示蹤技術中的應用。

基因工程標記法是皰疹病毒示蹤技術中常用的標記方法之一，具有穩(wěn)定性高、定位準確、可縮短曝光時間等優(yōu)勢。利用熒光蛋白標記皰疹病毒時，即使標記物和病毒蛋白的詳細結構是已知的，我們也無法預測其融合蛋白的精確結構。因此，構建一株功能完善的表達熒光蛋白的重組病毒仍然是一個充滿不確定性、需要反復試驗的過程。皰疹病毒在結構上具有一定的共性，這使得熒光蛋白在皰疹病毒基因組中的插入位點具有普適性。例如UL35基因是熒光蛋白的常用插入位點，曾有文獻報道在HSV-1、PRV的該位點插入熒光蛋白的實例[4,23]。圖2展示了本研究團隊在PRV不同位點插入紅色和綠色熒光蛋白的重組病毒感染小鼠背根神經(jīng)節(jié) (Dorsal root ganglions，DRGs) 中的神經(jīng)元和豬腎上皮細胞 (PK-15) 后熒光蛋白的表達情況。表1列出了一些目前報道的皰疹病毒中熒光蛋白的插入位點。

2 病毒示蹤技術在皰疹病毒研究中的應用

可視化病毒示蹤技術因其方便、快速并能實時定位病毒感染等優(yōu)點而獲得了廣泛的應用，在皰疹病毒的研究中也不例外。此外，α皰疹病毒具有嗜神經(jīng)性和在神經(jīng)細胞中傳導的特性。因此，可視化病毒示蹤技術也促進了神經(jīng)解剖學和病毒神經(jīng)傳導方面的研究。

圖1 不同的熒光標記物在生物示蹤技術中的應用 (改編自參考文獻[19–22])

圖2 綠色或紅色熒光蛋白標記的PRV感染神經(jīng)元和PK-15細胞后的熒光蛋白表達情況

表1 熒光蛋白與皰疹病毒結構蛋白融合表達的實例 (改編自參考文獻[6])

2.1 在病毒入侵、復制和釋放相關研究中的應用

Liu等利用轉座的原理將HaloTag蛋白標簽成功插入到PRV基因組中，使HaloTag與VP26融合表達，產(chǎn)生重組病毒rPRV-HT。病毒感染細胞之后，可以通過不同的HaloTag配體使重組病毒產(chǎn)生不同顏色的熒光，從而區(qū)別親本病毒和子代病毒，實現(xiàn)對病毒黏附、衣殼入侵以及子代病毒釋放的可視化。結合單顆粒示蹤技術，最終揭示了PRV生命周期的機制，獲得了病毒入侵和復制過程的全局圖像數(shù)據(jù)[2]。

皰疹病毒在宿主細胞的核內復制，最終形成相似的病毒粒子結構。病毒基因組由核孔入核，首先表達IE蛋白 (Immediate-early proteins)，從而調控E蛋白 (Early proteins) 的表達，最終起始病毒基因組在復制區(qū)室 (Replication compartments，RCs) 的復制[46]。通過熒光蛋白標記可以實現(xiàn)病毒復制組裝中間體形成過程的可視化，進而揭示病毒復制和組裝的詳細過程[47]。在病毒入侵的每個細胞中，僅有限數(shù)量的基因組獲得表達，而且只有這些基因組進行復制并包裝成病毒粒子[48]。Kobiler等利用分別與PRV VP26融合表達紅色熒光蛋白 (Red fluorescent protein，RFP)、增強型綠色熒光蛋白 (Enhanced green fluorescent protein，EGFP)、藍綠色熒光蛋白 (Cyan fluorescent protein，CFP) 的3株重組病毒研究發(fā)現(xiàn)，每個RC起源于單個病毒基因組，且每個細胞中僅有少于7個的病毒基因組可以進行復制[48]。

新合成病毒粒子的轉運和釋放是一個高度動態(tài)的過程，涉及病毒組分與宿主膜轉運系統(tǒng)的協(xié)同作用。衣殼和病毒基因組在細胞核內組裝之后，通過出芽方式穿過內外核膜離開細胞核[49]。分泌途徑中產(chǎn)生的病毒膜蛋白被轉運至二次包膜 (Secondary envelopment) 部位，目前認為這種包膜是轉運高爾基體膜和/或內體膜[50-51]。病毒顆粒通過出芽的方式獲得其囊膜，在細胞內囊泡中產(chǎn)生有囊膜的病毒粒子。之后這種含病毒粒子的轉運囊泡被運輸至細胞質膜，病毒粒子通過胞吐方式離開感染的細胞[36]。關于病毒釋放過程的這些描述雖然被廣泛接受，但涉及具體機制的相關研究還不夠充分。Hogue等利用pH敏感型的GFP與病毒gM蛋白融合表達的重組PRV毒株，通過單顆粒示蹤技術實現(xiàn)了對病毒釋放過程的可視化[36]。

Scherer等利用一株能夠穩(wěn)定表達PRV mNG-VP26融合蛋白的PK-15細胞系和能夠表達VP26-RFP融合蛋白的重組PRV構建了一個雙熒光報告系統(tǒng)，利用這個系統(tǒng)構建的重組病毒命名為PRV180G，該重組病毒的衣殼能同時表達綠色和紅色熒光蛋白。重組病毒在神經(jīng)元細胞中感染并復制之后，所有的PRV180G子代病毒都僅含有mRFP-VP26標記的衣殼。Scherer等利用PRV180G來分析外周神經(jīng)元軸突中PRV衣殼的轉運動力學發(fā)現(xiàn)，在病毒入侵時，胞漿動力蛋白 (Dynein) 和驅動蛋白 (Kinesin) 都可介導衣殼的雙向轉運，而且轉運活動比較活躍，而在子代病毒釋放時，衣殼的轉運僅由驅動蛋白介導[5]。

2.2 在病毒潛伏感染研究中的應用

皰疹病毒能在其宿主的特定細胞內建立并維持長期的潛伏感染[52]。潛伏感染的特征是僅表達有限數(shù)量的轉錄本——潛伏相關轉錄本 (Latency- associated transcripts，LATs)，且不會合成子代病毒[53-55]。潛伏感染的建立、維持和再激活需要多種病毒和細胞蛋白的協(xié)同作用。

Koyuncu等利用表達單體紅色熒光蛋白的PRV對神經(jīng)元的感染模式進行了研究。利用經(jīng)元三室神培養(yǎng)系統(tǒng)將神經(jīng)元胞體和軸突在分隔的不同區(qū)室中培養(yǎng)。以不同感染復數(shù) (Multiplicity of infection，MOI) 的重組病毒感染軸突區(qū)室時發(fā)現(xiàn)，當MOI低于0.1時，傳導至神經(jīng)核的病毒基因組是“靜止”的，即建立了潛伏感染，而且這些“靜止”的基因組可以被復制缺陷型的PRV再激活。最終結果表明感染劑量的不同和感染環(huán)境的多樣性對于神經(jīng)元中的感染狀態(tài) (復制或潛伏感染) 具有決定性的影響[56]。

α皰疹病毒潛伏感染時，病毒基因組僅限于表達LATs。HSV-1的全長LAT長約8.3 kb，可被剪接為穩(wěn)定的1.5 kb和2 kb的內含子，以及6.3 kb的LAT外顯子，6.3 kb的外顯子最終被加工成一系列microRNAs[57]。已經(jīng)證實LATs和相關的microRNAs能夠在體外限制HSV-1 IE基因 (Immediate-early gene) 的表達[58-59]，并能限制小鼠模型中病毒復制相關基因的轉錄[60-61]。Michael等利用一系列表達GFP和螢火蟲熒光素酶 (Firefly luciferase) 的重組HSV-1毒株，結合體內和體外試驗證明，LATs可以抑制病毒復制相關基因的表達，并能抑制神經(jīng)元中潛伏感染的病毒基因組的再激活[57]。

HCMV在人群中的感染率極高，可達90%以上，并可對免疫缺陷患者造成嚴重的后果[62]。目前已在不同類型細胞上建立了HCMV潛伏感染模型，包括造血干細胞、粒細胞、巨噬細胞等，但神經(jīng)細胞潛伏感染模型鮮有報道[63-64]。Cheng等利用一株表達GFP的HCMV作為指示病毒，成功在惡性膠質瘤細胞T98G細胞系中建立了潛伏感染模型，為研究HCMV引起的神經(jīng)退行性后遺癥奠定了基礎[65]。

2.3 在病毒神經(jīng)傳導研究中的應用

很多病毒可以感染神經(jīng)細胞，但只有少數(shù)病毒可以跨突觸傳播：如水泡性口炎病毒 (Vesicular stomatitis virus，VSV)、狂犬病病毒 (Rabies virus，RV) 以及α皰疹病毒。神經(jīng)傳導需要病毒入侵神經(jīng)元 (第一級神經(jīng)元) 并進行復制，然后將包裝的病毒基因組在突觸連接部位或其附近轉運到第二級神經(jīng)元進行再次復制。這種自我擴增的特性使得第一級、第二級和第三級神經(jīng)元都能被標記[66]。圖3是皰疹病毒在神經(jīng)軸突中逆行傳導后建立潛伏感染的示意圖[56]。

PRV感染神經(jīng)元需要病毒粒子沿著長距離軸突的雙向運輸[3,67]。病毒入侵外周神經(jīng)元的軸突末端，并逆行運輸至神經(jīng)元胞體而建立潛伏感染。潛伏狀態(tài)的病毒被再激活時，新合成的病毒粒子沿著軸突順行傳導至外周[3]。PRV高度保守的US9蛋白是病毒在體內外順行傳導所必需的[34]。在通過軸突運輸之前，PRV核衣殼與內膜蛋白形成的病毒粒子前體通過二次包膜過程納入由轉運高爾基體衍生出的囊泡中。這一過程產(chǎn)生的病毒顆粒同時含有病毒和宿主的膜蛋白[3]。Taylor等利用US9-GFP融合表達的重組PRV感染大鼠頸上神經(jīng)節(jié)中的原代神經(jīng)細胞，通過活細胞的實時成像證實，US9-GFP能夠與在軸突中順行傳導的病毒顆粒共轉運[37]。若缺失US9，病毒顆粒可以在神經(jīng)元胞體中組裝，但不能在軸突中運輸[68]。綜合這些研究結果，說明US9是利用一些未知的病毒或宿主蛋白介導神經(jīng)元內病毒粒子轉運的。Kramer等利用質譜法鑒定了與US9-GFP相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)KIF1A能與US9-GFP相互作用。KIF1A是宿主的一種微管依賴性驅動蛋白 (Kinesin)，在軸突其他物質的轉運中具有重要的作用[69-70]。KIF1A與病毒顆粒共轉運，且對KIF1A的顯性位點失活突變后可干擾病毒顆粒的順行傳導[45]。這些研究結果表明，PRV能夠有效利用宿主神經(jīng)元內軸突的運輸機制在宿主體內進行傳播。

圖3 α皰疹病毒擴散到外周神經(jīng)系統(tǒng)并建立潛伏感染的示意圖 (改編自參考文獻[56])

2.4 在神經(jīng)通路示蹤研究中的應用

皰疹病毒在神經(jīng)通路示蹤方面的應用主要包括探究外周神經(jīng)系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)間的聯(lián)系通路和CNS內局部環(huán)路兩方面。此外，皰疹病毒作為神經(jīng)通路示蹤劑的優(yōu)勢是其能夠在神經(jīng)環(huán)路中復制，因此可以放大示蹤信號，增加示蹤的靈敏度。PRV通常作為逆向的神經(jīng)示蹤劑揭示傳入神經(jīng)通路[71]。Krout等利用GFP與β半乳糖苷酶 (β-gal) 標記的PRV對中樞神經(jīng)的神經(jīng)元的功能進行了研究。將GFP-PRV注射入星狀神經(jīng)節(jié)，將β-gal-PRV注射入初級運動皮層，通過鑒定雙標記的神經(jīng)元，揭示了中樞神經(jīng)元可能支配的神經(jīng)通路[72]。而HSV-1通常作為順行的神經(jīng)環(huán)路示蹤劑揭示傳出神經(jīng)網(wǎng)絡[73-74]。Zeng等利用細菌人工染色體 (BAC) 技術構建了能夠同時表達4個GFP分子的HSV-1 H129株，高熒光強度使其能夠有效標記神經(jīng)元并對其詳細形態(tài)學實現(xiàn)可視化，包括對樹突、棘突和軸突纖維的可視化。將基因敲除后，可實現(xiàn)對單個突觸的示蹤，通過對神經(jīng)環(huán)路細節(jié)的可視化以及對神經(jīng)網(wǎng)絡的標記，有助于提升我們對中樞神經(jīng)系統(tǒng)內神經(jīng)網(wǎng)絡的認識，也為研究神經(jīng)退行性腦疾病提供了參考和借鑒意義[75]。

2.5 PRV報告病毒在示蹤技術中的系統(tǒng)應用

國際著名皰疹病毒學家Enquist的團隊在近20年的研究中，以PRV為模型，構建了一系列表達不同熒光蛋白的重組報告病毒，并且利用這些報告病毒對PRV感染宿主的過程進行了示蹤，進而揭示了病毒的復制、細胞內轉運以及釋放等過程的詳細機制，同時闡明了α皰疹病毒潛伏感染、在神經(jīng)軸突中傳導的相關機制以及宿主神經(jīng)通路的結構[45,56,67,76]。他們在病毒基因組的不同位點 (gM、gG、US9、UL35等) 插入不同的熒光蛋白 (GFP、YFP、RFP、mCherry、mNeonGreen等) 構建了一系列示蹤病毒，為人類皰疹病毒示蹤的相關研究提供了重要參考[4,36,77]。

Enquist等以PRV Bartha株為骨架，利用Cre-Lox重組系統(tǒng)獲得的PRV-267和PRV-263，在感染同一個神經(jīng)元細胞時，由于發(fā)生不同的重組而產(chǎn)生不同的報告子表型，從而產(chǎn)生表達不同熒光的病毒，利用這兩株病毒對大鼠腦干髓質區(qū)神經(jīng)回路進行了分析[76]。他們也分別以PRV Becker和PRV 180 (RFP與病毒小衣殼蛋白VP26融合表達) 為骨架，在囊膜蛋白gM之后插入pH敏感型的綠色熒光蛋白pHluorin，獲得重組病毒PRV 486和PRV 483，利用這一系列報告病毒并基于相關研究基礎，Enquist等建立了α皰疹病毒在細胞內轉運以及由胞吐作用介導的釋放的完整模型[36]，并闡明了病毒顆粒、L-顆粒 (僅含有衣殼、外膜蛋白或囊膜蛋白，無病毒核酸) 以及糖蛋白的分泌機制[78]。

2.6 雙熒光標記在皰疹病毒示蹤技術中的應用

與單獨的熒光蛋白標記相比，雙色熒光蛋白標記在研究病毒感染機制以及病毒與宿主相互作用中更具優(yōu)勢?？梢酝ㄟ^同時標記病毒衣殼、外膜或囊膜實現(xiàn)對病毒粒子的雙色標記[79]；也可通過標記病毒粒子，利用熒光補充型細胞系實現(xiàn)雙色標記[5]；此外，還可以利用示蹤劑與不同配體的相互作用實現(xiàn)雙色甚至多色標記[2]。

Enquist等利用雙色標記的PRV實現(xiàn)了對皰疹病毒在軸突內轉運動態(tài)的追蹤，闡明了不同的運輸?shù)鞍讓τH代和子代病毒粒子的轉運機制[5]。Kerstin等分別利用EGFP和mCherry標記了HCMV的內膜蛋白pp150和囊膜蛋白gM，實現(xiàn)了對HCMV感染的雙色示蹤，揭示了其入侵機制[79]。

圖4系統(tǒng)展示了病毒示蹤技術在皰疹病毒相關研究中的應用。

圖4 病毒示蹤技術在皰疹病毒研究中的應用 (改編自參考文獻[2,56])

3 皰疹病毒示蹤技術的發(fā)展前景

自病毒示蹤技術應用到皰疹病毒的研究中以來，一個個難題得以攻克。然而，關于病毒生命周期、病毒與宿主相互作用等方面依然存在很多未闡明的機制。隨著科學技術的發(fā)展、更加靈敏的新的熒光蛋白的合成、高效監(jiān)測儀器的發(fā)明，相信我們未來依然會利用其解決更多的科學問題。

例如，Kobiler等利用表達RFP、EGFP、CFP三種熒光蛋白的重組PRV研究發(fā)現(xiàn)，皰疹病毒的RC起源于單個病毒基因組，且每個細胞中僅有極少數(shù)的病毒基因組可以啟動復制[48]。但他們同時也發(fā)現(xiàn)部分RC來源于2個病毒基因組，將這種RC稱為“雙基因組RC”。對于這一現(xiàn)象有3種解釋：一是發(fā)生了病毒的重組；二是這種“雙基因組RC”事實上來源于單個基因組，只是在一個基因組復制的過程中，鄰近的基因組與其復制不同步，從而只檢測到一個RC；第三種可能性是“雙基因組RC”可能是獨立形成的兩個RC的重疊[80]。因此，假設利用病毒示蹤技術對單個基因組進行標記，然后持續(xù)監(jiān)測到其形成RC，這樣的實時活細胞可視化模型可以解決這一問題，從而對RC的形成過程進行可視化的監(jiān)測。

PRV囊膜蛋白US9通過募集驅動蛋白KIF1A參與順行神經(jīng)傳導[45]。但是，KIF1A與US9相互作用還需要其他未知病毒蛋白的協(xié)助，如果可以將多種病毒蛋白、宿主成分利用不同的熒光標記物同時標記，就可以將這一過程進行更加細致的可視化，從而揭示PRV在軸突傳導過程的詳細機制，不僅如此，這樣的研究方法同樣適用于其他α皰疹病毒的神經(jīng)傳導研究。

病毒學家也已經(jīng)開始利用超高分辨率顯微鏡進行相關的研究[49,81-82]，這非常有助于對皰疹病毒內膜層網(wǎng)狀蛋白的觀測以及對病毒相關的胞內結構的鑒定，如組裝中間體 (Assemblons) 、RC等。目前已利用超高分辨率技術測量了PRV顆粒中結構蛋白的不對稱分布以及HSV-1顆粒中內膜蛋白的徑向分布[83-84]。未來需要對超高分辨率技術的速度和靈敏度進行優(yōu)化，以實現(xiàn)對病毒復制周期的超高分辨率的觀測。

4 結語與展望

可視化病毒示蹤技術應用于皰疹病毒的相關研究，成功地揭示了皰疹病毒入侵、復制、胞內轉運、組裝、釋放以及潛伏感染等生命活動的詳細機制，也促進了神經(jīng)解剖學和病毒神經(jīng)傳導方面的研究。隨著病毒示蹤技術所需的熒光標記物、標記策略和監(jiān)測儀器的不斷發(fā)展和完善，可視化的病毒示蹤技術將更加方便、快捷、經(jīng)濟、有效地用于皰疹病毒的相關研究。

目前的示蹤技術尚不完善，雖然可以實現(xiàn)對于多種病毒蛋白的可視化標記，但對病毒核酸的標記仍舊是一大難題；熒光原位雜交技術雖然可以實現(xiàn)對DNA或RNA的原位標記，特別是近年來報道的RNAscope技術[85]，但該技術需要對組織進行固定和染色，即無法實現(xiàn)對病毒核酸在宿主細胞內一系列生命活動的實時追蹤，期待未來在病毒核酸標記方面能有所突破；將熒光蛋白插入病毒基因組的基因工程技術具有穩(wěn)定性好、熒光蛋白表達效率高等優(yōu)點，但也存在使病毒感染能力減弱的問題，此外還存在熒光蛋白在細胞內形成多聚體的報道，對病毒的生命活動具有不良的影響[23]。因此，探索更加適宜插入熒光蛋白的位點或更加優(yōu)良的標記方法依然是待解決的技術難題。有機染料和肽類標記物雖然對病毒的感染能力無削弱，但是存在結合不牢的缺點，跟熒光蛋白相比標記能力差。未來需要探尋分子量更小的熒光蛋白以及結合性更強、更特異的染料和肽類標記物。

利用示蹤劑實現(xiàn)對皰疹病毒單個生命過程的研究有很多，但是對兩個或多個相關生命過程的同步示蹤還鮮有報道，這可能也是未來需要突破的難點。

此外，今后需要研發(fā)更加經(jīng)濟實惠、熒光強度高、對病毒活性影響小的標記物；仍需不斷探索更加簡便、普適性的標記策略；仍需不斷研發(fā)更加靈敏的監(jiān)測儀器。如何使病毒示蹤技術與生物技術手段更加高效地結合應用，突破各領域之間的界限，一直是研究者亟待解決的難題。

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Tracking of herpesviruses: what have been seen and will be seen?

Yalin Wang, Huaji Qiu, and Yuan Sun

State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069, Heilongjiang, China

Viral infection of cells is a highly intricate process that involves the complex virus-cell interactions. Recently, virologists can monitor the virus life cycle at the primary infection site in real-time using various virus tracking techniques. Herpesviruses, a class of large enveloped DNA viruses, are important pathogens threatening the health of humans and animals. This review discussed the applications of different virus tracking techniques in herpesvirus studies, to provide new insights into virus-cell interactions and replication mechanisms of herpesviruses. Though the techniques have widely been exploited, some issues need to be addressed, such as the selection of the optimal site to insert reporters and the inability to track the whole process of the virus life cycle. With the updated tracking techniques, hopefully, more complex replication mechanisms of herpesviruses will be revealed in detail.

virus tracking techniques, herpesvirus, fluorescent protein, replication, latent infection, transport in axon

February 8, 2018;

June 11, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31570149).

Huaji Qiu. Tel/Fax: +86-451-51051708; E-mail: huajiqiu@caas.cn

Yuan Sun. Tel/Fax: +86-451-51051709; E-mail: sunyuan@caas.cn

10.13345/j.cjb.180057

國家自然科學基金(No. 31570149) 資助。

2018-07-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180704.1636.001.html

(本文責編 陳宏宇)